一种提高微生物法制备耐热耐碱性过氧化氢酶产量的方法技术

一种提高微生物法制备耐热耐碱性过氧化氢酶产量的方法，其特征是：　　　　Ａ．以金黄色嗜热子囊菌（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＩＦＯ９８６２为生产菌种；　　　　Ｂ．发酵培养基采用混合碳源，以１０ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌ糊精和培养基体积比为０．５％～３％的乙醇为混合碳源；　　　　Ｃ．发酵初始添加诱导剂，在发酵初始时加入０．０５％～０．５％的Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

，涉及金黄色嗜热子囊菌发酵制备过氧化氢酶。
技术介绍
过氧化氢酶是一种催化效率非常高的生化酶，在食品、医药、临床等行业一直有着广泛的用途。它可作为消除啤酒、饮料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化剂。与葡萄糖氧化酶并用作氧的去除剂，牛乳杀菌及干酪原料乳的杀菌。在临床分析中，对研究自由基代谢失衡，抗衰老和肿瘤发病机理具有一定价值，对某些疾病的诊断，鉴别诊断亦具有重要意义。在医药方面，可用于隐形眼镜消毒过程中残留过氧化氢的分解。过氧化氢酶还与H2O2同时使用，用于橡胶成型，塑料及多泡性粘合剂。近年来随着H2O2在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对过氧化氢酶的需求呈大幅增长趋势。其中在织物染整工艺中，采用过氧化氢酶去除漂白废液中残余H2O2，不仅能避免给后续染色工序带来问题，大幅度提高过氧化氢去除率从而确保染色的良好可再现性，还能使漂染同浴，节省大量的水、电、汽的消耗并显著提高生产效率。动物肝脏是过氧化氢酶的一个很大来源，国内外均已实现这一工艺的工业化生产。巴西研究者最近开发了从人胎盘中提取医用过氧化氢酶的技术。现有纺织用商品过氧化氢酶基本由丹麦诺维信公司垄断，它来源于经基因改性后的黑曲霉。国内用微生物生产过氧化氢酶尚停留在研究阶段，研究用菌种有溶壁微球菌、黑曲霉、嗜热链霉菌，生产水平较低。在织物染整工艺中运用过氧化氢酶实现漂染同浴虽然具有良好的经济效益和环保效益，但实现这一工艺的主要问题是在高温和强碱性条件下过氧化氢酶的稳定性问题。从人或动物脏器中提取的过氧化氢酶热稳定性很差，且受来源和季节等因素影响较大。细菌过氧化氢酶的热、碱稳定性虽然可随来源不同而不同，但大都为胞内酶，实现高产和提取均不方便。用工程菌合成的过氧化氢酶，则仅限于性质研究，没有开展生产性的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术的技术方案菌种金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862。购自日本国NITE Biological Resource Center Biotechnology Center National Lnstitute ofTechnology and Evaluation培养基斜面培养基PDA(g/L)马铃薯200，葡萄糖20，琼脂16，pH 6.0。种子培养基(g/L)酵母膏4，玉米淀粉15，K2HPO41，Na2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，pH 6.8。发酵培养基(g/L)糊精10～30，乙醇0.5％～3％(培养基体积比)，蛋白胨5～20，K2HPO45，KH2PO4·3H2O 3，MgSO4·7H2O 2，pH 7.0。培养方法将成熟的孢子接种到PDA斜面上，45℃下培养6-8d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用无菌水制成孢子悬液接种于种子培养基中，45℃摇床培养至对数生长后期。吸取种子培养液，按5-12％的接种量接种于发酵培养基中，45℃摇床培养84h或5L生化反应器培养5天。过氧化氢酶活性测定发酵液经真空抽滤后的清液直接用于过氧化氢酶活力的分析。过氧化氢酶活力采用分光光度法在25℃下测定。反应总体积为3mL，含0.1ml酶液和2.9ml含有10mmol/L H2O2的50mmol/L的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)。过氧化氢的分解速率用752型紫外-可见光分光光度计在240nm下测定。酶活定义为在25℃下，每分钟分解1μmnol H2O2所需的酶量为一个酶活单位。还原糖的测定3，5-二硝基水杨酸比色法。总糖的测定蒽酮比色法。提高过氧化氢酶产量的培养方式1.添加混合碳源以10g/L蛋白胨为氮源，采用10g/L～30g/L糊精和0.5％～3％乙醇为混合碳源，实现了过氧化氢酶水平和菌体量较大幅度的提高。其中酶产量与以乙醇和糊精分别为单一碳源时相比分别提高了291％和81％，即从408U/mL、882U/mL提高到1594U/mL。与采用乙醇为单一碳源时相比，混合碳源的菌体生长更好；与以糊精为单一碳源相比，混合碳源对过氧化氢酶合成的抑制作用远远小于以糊精为单一碳源时的情况。2.初始添加诱导剂在工艺1的基础上，在发酵初始时加入0.05～0.5％的H2O2，发酵结束时发酵液中的过氧化氢酶活力可达2762U/mL。摇瓶培养时，在工艺1、2的基础上，将摇床转速在菌体开始生长的4～36小时后，由100r·min-1提高到200r·min-1，实现了过氧化氢酶的高表达，发酵终了时培养基中过氧化氢酶水平为3015U/mL。5L发酵罐培养时，罐中装3L培养基，实罐灭菌，冷却后用NaOH调节pH至7.0。通气量为0.5vvm～1.5vvm，搅拌转速为300r·min-1～500r·min-1，接种量为2％～10％。培养基中乙醇的添加方式改为流加，用于流加的乙醇预先经孔径为0.2μm的无菌滤膜过滤，流加速率为0.1～1.0mL/h。5天后发酵液中过氧化氢酶水平达到3567U/mL。本专利技术的有益效果，本专利技术选用的金黄色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus IFO9862)合成的过氧化氢酶为胞外酶，并且是迄今为止已报道过的热、碱稳定性最好过氧化氢酶，用于高温和碱性的织物染整工艺具有很大的潜力。摇瓶培养和在5L发酵罐中的实验水平均达国内领先水平。通过发酵工艺优化，摇瓶培养时，发酵终了时过氧化氢酶的水平达3015U/mL。在5L发酵罐中恒速流加乙醇，5天后过氧化氢酶水平达到3567U/mL。具体实施例方式实施例1以乙醇为单一碳源，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为408U/mL。实施例2以糊精为单一碳源，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为882U/mL。实施例3采用由糊精和乙醇组成的混合碳源，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为1594U/mL。实施例4在实施例3的基础上，发酵初始添加0.05％～0.5％的H2O2，培养基其余组分及培养方法如说明书所述，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为2762U/mL。实施例5在实施例4的基础上，将摇床转速在菌体开始生长的4～36小时内由100r·min-1迅速提高到200r·min-1，实现了过氧化氢酶的高表达，发酵终了时培养基中过氧化氢酶水平为3015U/mL。实施例65L发酵罐培养时，罐中装3L培养基，实罐灭菌，冷却后用NaOH调节pH至7.0。通气量为0.5vvm～1.5vvm，搅拌转速为300r·min-1～500r·min-1，接种量为2％～10％。培养基中乙醇的添加方式改为流加，用于流加的乙醇预先经孔径为0.2μm的无菌滤膜过滤，流加速率为0.1～1.0mL/h。5天后发酵液中过氧化氢酶水平达到3567U/mL。权利要求1.，其特征是A.以金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862为生产菌种；B.发酵培养基采用混合碳源，以10g/L～30g/L糊精和培养基体积比为0.5％～3％的乙醇为混合碳源；C.发酵初始添加诱导剂，在发酵初始时加入0.05％～0.5％的H2O2。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是摇瓶发酵时还提高摇床转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，李寅，方芳，伦世仪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：