大额牛精液低温冷冻保存方法技术

本发明专利技术涉及一种大额牛精液低温冷冻保存方法，属生物技术领域。本发明专利技术利用滴冻法对大额牛精液进行冷冻保存。冷冻液的配方为卵黄１５％－２０％ｖ／ｖ、甘油３％－６％ｖ／ｖ、乳糖１．０Ｍ－１．５Ｍ和蔗糖１．０Ｍ－１．５Ｍ；防冻液与精液稀释比例为１∶１０、稀释后的精液放置在室温下平衡１小时，再转移到４℃冰箱中平衡３小时；冷冻精液的品质判定指标为：解冻复速率不低于７０％；精子体外存活时间在解冻后放入３７℃、５％ＣＯ↓［２］培养箱中进行培养１小时后，运动度不小于３０％；金黄地鼠裸卵穿透率不低于３８％；精液在５０ｍＯｓｍ／ｋｇ的低渗溶液中，３８℃的５％ＣＯ↓［２］培养相中培养１小时，精子肿胀率不低于３９％。本发明专利技术具有实用且效果可靠，提供的大额牛冷冻精液品质的判定方法和判定指标科学、规范等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属生物

技术介绍
精液的冷冻保存在现代畜牧业中起着十分重要的作用。使用冷冻精液可以不受时间、地域和种畜寿命的限制，减少公畜饲养数量，降低生产成本，提高优良畜种的利用率，为畜牧业生产带来巨大的经济效益。同时，精液的冷冻和冷冻精液的使用在畜种引进、血缘更新、疾病控制、濒危品种以及遗传多样性保护上都有极其重要的意义。大额牛(Bos frontalis)是一种半野生、半家养的世界珍贵动物品种，具有耐粗饲、抗逆性强、肉质细嫩等特点，是一种有待开发、极有推广前景的品种。由于无计划宰杀，数量锐减，濒于灭绝，1997年被农业部列为国家重点保护品种。大额牛由于发现较晚，有关研究还只见于细胞核型、起源和进化以及遗传多样性等方面。专利技术者将本专利技术的方法和结果在相关文献数据库中进行搜索比较，未发现有任何相同记载。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于前人的基础研究，提供一种适合大额牛精液低温冷冻保存及冷冻精液的品质评定指标，为物种保护和合理利用提供有益的技术。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案一、大额牛精液的低温冷冻保存1)精液的采集和常规检查按奶牛的现有方法进行。2)防冻液配置卵黄15％-20％(v/v)，甘油3％-6％(v/v)，乳糖1.0M-1.5M，蔗糖1.0M-1.5M。按量称取乳糖和蔗糖，溶于60-70毫升超纯水中。取新鲜鸡蛋，用75％乙醇消毒蛋壳，去掉蛋清，把包有完整卵黄膜的卵黄放在干净的滤纸上，用滤纸吸干卵黄膜上的蛋清，持干净注射器刺破卵黄膜，抽取卵黄，按所需用量把卵黄加入糖溶液中，拌匀，再用双层纱布过滤一次，取滤液，10000g离心20分钟。取上清液加青霉素100IU/ml，硫酸链霉素100μg/ml，按量加入甘油。定容，置低温冰箱中保存。3)精液的稀释将防冻液预热到37℃，按1∶10稀释(防冻液∶精液)。稀释后的精液放置在室温下平衡1小时，再转移到4℃冰箱中平衡3小时。4)精液的冷冻和保存冷冻采用滴冻法。在干冰上或在预冷到-80℃左右的铜板上进行。每滴约0.2ml，滴在干冰上或铜板上的精液滴几分钟内便可硬化，表面变光亮，5-7分钟后立刻转移到液氮中，冷冻的精液做好标记，放入液氮中保存。5)冷冻精液的解冻取1mlPBS解冻液放入试管内，预热至37℃，取一颗冷冻精液放入试管中复苏，轻轻摇匀。二、冷冻精液的品质评定方法和判定指标1)精子解冻复速率解冻后检查活精子数，复速率不低于70％。2)精子体外存活时间精液解冻后放入37℃、5％CO2培养箱中进行培养1小时后，运动度不小于30％。3)黄地鼠裸卵穿透检测(SPA)金黄地鼠经过超排、裸卵制备，精子经过获能、穿透培养。精卵共培3-5小时后固定，观察穿透率。穿透率不应低于38％。穿透率的计算为穿透率(％)＝被穿透的裸卵数/裸卵总数)×100％。4)精子低渗肿胀试验(HOS test)精液在50mOsm/kg的低渗溶液中，38℃的5％CO2培养相中培养1小时，精子肿胀率不低于39％。精子肿胀率(％)＝(起肿胀反应的精子数/总精子数)×100％。本专利技术的大额牛精液冷冻保存方法具有实用且效果可靠，提供的大额牛冷冻精液品质的评定方法和判定指标科学、规范等优点。具体实施例方式实施例一，经精液的采集、检查、防冻液配置、精液的稀释、精液的冷冻和保存、冷冻精液的解冻、冷冻精液的品质评定等步骤完成。部分步骤同现有技术。不同之处为1、液的配方为卵黄15％v/v，甘油3％v/v，乳糖1.0M，蔗糖1.0M，其余超纯水为60毫升； 2、精液的稀释为将冷冻液预热到37℃，按防冻液精液稀释为1∶10进行稀释，稀释后的精液放置在室温下平衡1小时，再转移到4℃冰箱中平衡3小时；3、精液的冷冻采用滴冻法，即在干冰上或在预冷到-80℃的铜板上滴0.2m的精液，当滴在干冰上或铜板上的精液滴硬化且表面变光亮5分钟后，放入液氮中保存；4、冷冻精液的品质判定指标为解冻复速率不低于70％；精子体外存活时间在解冻后放入37℃、5％CO2培养箱中进行培养1小时后，运动度不小于30％；金黄地鼠裸卵穿透率不低于38％；精液在50mOsm/kg的低渗溶液中，38℃的5％CO2培养相中培养1小时，精子肿胀率不低于39％。实施例二基本同实施例一。不同之处为1、冻液的配方为卵黄17.5％v/v，甘油4.5％v/v，乳糖1.25M，蔗糖1.25M，超纯水为65毫升；2、当滴在干冰上或铜板上的精液滴硬化且表面变光亮6分钟后，放入液氮中保存。实施例三基本同实施例一。不同之处为1、冻液的配方为卵黄20％v/v，甘油6％v/v，乳糖1.5M，蔗糖1.5M，超纯水70毫升；2、当滴在干冰上或铜板上的精液滴硬化且表面变光亮5-7分钟后，放入液氮中保存；权利要求1.，包括精液的采集、检查、防冻液配置、精液的稀释、精液的冷冻和保存、冷冻精液的解冻、冷冻精液的品质评定步骤，其特征在于(1)冷冻液的配方为卵黄15％-20％v/v，甘油3％-6％v/v，乳糖1.0M-1.5M，蔗糖1.0M-1.5M，其余为超纯水；(2)精液的稀释为将冷冻液预热到37℃，按防冻液∶精液稀为1∶10进行稀释，稀释后的精液放置在室温下平衡1小时，再转移到4℃冰箱中平衡3小时；(3)精液的冷冻采用滴冻法，即在干冰上或在预冷到-80℃左右的铜板上滴0.2m的精液，当滴在干冰上或铜板上的精液滴硬化且表面变光亮5-7分钟后，放入液氮中保存；(4)冷冻精液的品质判定指标为解冻复速率不低于70％；精子体外存活时间在解冻后放入37℃、5％CO2培养箱中进行培养1小时后，运动度不小于30％；金黄地鼠裸卵穿透率不低于38％；精液在50mOsm/kg的低渗溶液中，38℃的5％CO2培养相中培养1小时，精子肿胀率不低于39％。全文摘要本专利技术涉及一种，属生物
本专利技术利用滴冻法对大额牛精液进行冷冻保存。冷冻液的配方为卵黄15％－20％v/v、甘油3％－6％v/v、乳糖1.0M－1.5M和蔗糖1.0M－1.5M；防冻液与精液稀释比例为1∶10、稀释后的精液放置在室温下平衡1小时，再转移到4℃冰箱中平衡3小时；冷冻精液的品质判定指标为解冻复速率不低于70％；精子体外存活时间在解冻后放入37℃、5％CO文档编号A61K35/12GK1559440SQ200410022018公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月12日 优先权日2004年3月12日专利技术者维 司, 司维, 苏雷, 季维智 申请人:中国科学院昆明动物研究所本文档来自技高网...

【技术保护点】
大额牛精液低温冷冻保存方法，包括精液的采集、检查、防冻液配置、精液的稀释、精液的冷冻和保存、冷冻精液的解冻、冷冻精液的品质评定步骤，其特征在于：（１）冷冻液的配方为卵黄１５％－２０％ｖ／ｖ，甘油３％－６％ｖ／ｖ，乳糖１．０Ｍ－１．５Ｍ，蔗糖１．０Ｍ－１．５Ｍ，其余为超纯水；（２）精液的稀释为将冷冻液预热到３７℃，按防冻液∶精液稀为１∶１０进行稀释，稀释后的精液放置在室温下平衡１小时，再转移到４℃冰箱中平衡３小时；（３）精液的冷冻采用滴冻法，即在干冰上或在预冷到－８０℃左右的铜板上滴０．２ｍ的精液，当滴在干冰上或铜板上的精液滴硬化且表面变光亮５－７分钟后，放入液氮中保存；（４）冷冻精液的品质判定指标为：解冻复速率不低于７０％；精子体外存活时间在解冻后放入３７℃、５％ＣＯ↓［２］培养箱中进行培养１小时后，运动度不小于３０％；金黄地鼠裸卵穿透率不低于３８％；精液在５０ｍＯｓｍ／ｋｇ的低渗溶液中，３８℃的５％ＣＯ↓［２］培养相中培养１小时，精子肿胀率不低于３９％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：司维，苏雷，季维智，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]