日本血吸虫中国大陆株SjPP基因及其克隆、表达和应用制造技术

本发明专利技术涉及日本血吸虫中国大陆株ＳｊＰＰ基因的基因序列及其克隆表达方法和应用。本发明专利技术公开的日本血吸虫中国大陆株ＳｊＰＰ基因具有序列１所示的核苷酸序列和相应的序列２的氨基酸序列。本发明专利技术应用实验室繁殖的洞庭湖种群东方田鼠阳性血清和酶联葡球菌Ａ蛋白免疫筛选日本血吸虫中国大陆株成虫ｃＤＮＡ文库，经过初筛和３轮复筛获得５个阳性克隆。应用５′ＲＡＣＥ技术对其中一克隆的ｃＤＮＡ片段进行５′端延伸扩增，并利用ｂｌａｓｔ进行基因序列的同源性分析，结果表明该基因为一血吸虫新基因。本发明专利技术还公开了ＳｊＰＰ在大肠杆菌中的表达方法。本发明专利技术ＳｊＰＰ基因可用于制备防治日本血吸虫病重组蛋白疫苗和ＤＮＡ疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及日本血吸虫中国大陆株SjPP基因的基因序列及其克隆表达方法和应用。
技术介绍
血吸虫病是一种危害严重的人兽共患病，在世界范围内有6.5亿人受到威胁，约1.93亿人感染血吸虫病。抗血吸虫病疫苗的研究成为当前血吸虫病防治研究的热点之一。东方田鼠(Microtus fortis)亦称米氏田鼠(Microtus Michnoi)、长江田鼠、沼泽田鼠、苇田鼠，俗称湖鼠，属啮齿目(Rodentia)、仓鼠科(Cricitidae)、田鼠亚科(Microcinae)、田鼠属(Microcus)。分布在我国湖南、湖北、安徽、浙江、江苏、福建、四川、贵州、广东、黑龙江、内蒙古、吉林、山东、陕西、甘肃、宁夏、辽宁等省份，在中蒙、中俄、中朝等边境的湖泊沼泽地带也有其踪迹，是我国血吸虫病流行区洞庭湖湖洲广泛分布的一种优势鼠种。20世纪50年代初，我国曾对南方13个省、市39种哺乳动物进行血吸虫病调查，发现东方田鼠是唯一一种感染日本血吸虫后不致病的哺乳类动物。其后研究发现，东方田鼠对日本血吸虫的抗性是先天的、可遗传的，这种抗性既不因种群的地域性差别而不同，也不因相同地域内种群的传代而减弱。为探讨东方田鼠抗日本血吸虫病机制，将东方田鼠血清通过肌肉或尾静脉注射给昆明系小鼠。与对照组相比，被动转移血清组小鼠体内日本血吸虫虫体变小，肝、肠组织及粪卵EPG及毛蚴孵出率均明显减少。将东方田鼠新鲜血清与体外制备的血吸虫童虫体外共培养，获得显著的童虫死亡率。应用间接ELISA方法分析发现东方田鼠血清中存在天然抗日本血吸虫抗体，且以抗童虫可溶性抗原的抗体水平最高，抗成虫可溶性抗原的抗体水平次之。进一步研究发现，东方田鼠血清中IgG3抗体可能在抗病机制中发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术根据东方田鼠具有抗日本血吸虫病的特性，利用东方田鼠阳性血清筛选日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库，结果得到了一种日本血吸虫新的抗原基因SjPP，间接ELISA的实验结果表明，SjPP的重组表达蛋白可被东方田鼠阴性血清IgG3抗体所识别。本专利技术所要解决的技术问题在于公开日本血吸虫中国大陆株SjPP的基因序列。本专利技术公开的日本血吸虫中国大陆株SjPP基因具有序列1所示的核苷酸序列和相应的序列2的氨基酸序列。序列1的第18个至第923个核苷酸区域为序列2的编码区。本专利技术应用实验室繁殖的洞庭湖种群东方田鼠阳性血清和酶联葡球菌A蛋白免疫筛选日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库，经过初筛和3轮复筛获得5个阳性克隆。应用5′端RACE实验技术对其中一克隆的cDNA片段进行5′端延伸。利用blast进行基因序列的同源性分析，结果表明该基因为一血吸虫新基因。DNA序列分析表明该基因(SjPP)的开放阅读框含906bp，编码302个氨基酸，起始密码子符合Kozak序列特征。SjPP基因编码产物与人的PP6、鼠PP6、果蝇PPV等蛋白的氨基酸序列具有高度一致性，分别达72％、70％和70％，其理论分子量为34.7kDa，等电点(pI)为5.31。利用PSORT在线预测蛋白质信号肽软件分析，在N端未发现信号肽的存在。以Tmpred软件也未预测出蛋白质跨膜区的存在。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述日本血吸虫中国大陆株SjPP基因在大肠杆菌中的表达方法。本专利技术公开的日本血吸虫中国大陆株SjPP基因在大肠杆菌中的表达方法包括下列步骤1.SjPP基因的RT-PCR扩增上游引物为5′-GCGAAGCTTCAATGGACTTGGATCAGTGG-3′下游引物为5′-CGGCTCGAGTTACAAGAAGTACGGAGTA-3′2.重组表达质粒pET28a(+)/SjPP的构建3.转化BL21(DE3)表达菌后用IPTG诱导表达表达产物经SDS-PAGE电泳分析显示，重组蛋白以包涵体形式高效表达，融合蛋白分子量大约在39kDa左右。Western-blotting显示重组抗原具有良好的抗原性。用Ni柱纯化目的蛋白。本专利技术所要解决的另一技术问题在于公开上述日本血吸虫中国大陆株SjPP基因在制备防治日本血吸虫病重组疫苗中的应用。将SjPP基因亚克隆至真核表达质粒pCMV-Script中，构建成DNA疫苗pCMV-Script/SjPP。在BALB/c小鼠免疫保护实验中，重组蛋白pET28a(+)/SjPP诱导的减虫率、减雌率、肝组织减卵率、粪便减卵率分别是18.18％、19.00％、15.44％、32.23％，DNA疫苗诱导的相应值为26.77％、29.63％、23.91％、31.91％。下面结合实施例对本专利技术作进一步的描述。附图说明图1pET28a(+)/SjPP重组质粒双酶切鉴定其中MDNA Marker 2000，1pET28a(+)/SjPP重组质粒HindIII/XhoI双酶切，2pET28a(+)质粒HindIII/XhoI双酶切图2pET28a(+)/SjPP重组质粒PCR鉴定MDNA Marker 2000，1pET28a(+)/SjPP重组质粒PCR产物图3SDS-PAGE分析IPTG诱导的不同表达时相的融合蛋白M蛋白质标准分子量1，2，3，4，5，6重组质粒pET28a(+)/SjPP在IPTG诱导后0h、0.5h、1h、2h、4h、6h的表达产物7空质粒pET28a(+)在IPTG诱导后6h的表达产物图4SjPP重组蛋白的Western-blottingM蛋白质标准分子量1pET28a(+)/SjPP表达产物2pET28a(+)表达产物图5pCMV-Script/SjPP重组质粒检测MDNA Marker 2000，1pCMV-Script/SjPP重组质粒PCR产物，2pCMV-Script/SjPP重组质粒HindIII/XhoI双酶切具体实施方式实施例1东方田鼠阳性血清免疫筛选日本血吸虫cDNA文库及SjPP全长基因的克隆1.实验材料1.1.实验动物实验室传代的健康东方田鼠(洞庭湖种群)由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，8周龄。新西兰大白兔，雄性，购自上海罗泾飞达实验动物养殖场，体重2.5kg。1.2.日本血吸虫(中国大陆株)尾蚴(安徽品系)中国农科院上海家畜寄生虫病研究所钉螺室提供。1.3.质粒、菌种大肠杆菌DH5α、pUCm-T载体购自上海申能博彩生物科技有限公司，DH10B(ZIP)购自GIBCOBRL公司。1.4.文库日本血吸虫成虫cDNA文库采用定向克隆法将目的cDNA片段插入到λZipLox载体中，雌、雄虫文库库容量分别为3.74×106、3.28×106，重组率都在96％以上，插入片段多在0.5-2kb之间。1.5.主要试剂及工具酶酶联葡球菌A蛋白购自上海科欣生物技术研究所。Red Taq购自赛百盛基因技术有限公司。5′RACE试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶HindIII、XhoI、DNA Marker DL2000等均购自TaKaRa公司。1.6.5′RACE的引物SjPP-P 5′-(P)GTCCGCATGCTGTG-3′SjPP-S15′-ACTGCGATATCCAACAGCAA-3′SjPP-A15′-CTTCATCTGGCACAGCTTCA-3′SjPP-S25′-ACGGATCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种日本血吸虫中国大陆株ＳｊＰＰ基因，其特征在于该基因具有如下的核苷酸序列及相应的氨基酸序列：ｇｇｇａａｔｔｔｇｃｃｃｔｔｇｃａａｔｇｇａｃｔｔｇｇａｔｃａｇｔｇｇａｔａｃａｇｔｃｔｇｔｃ ａａｇ５０ＭｅｔＡｓｐＬｅｕＡｓｐＧｌｎＴｒｐＩｌｅＧｌｎＳｅｒＶａｌＬｙｓ１５１０ａｃｔｔｇｔａａｇｔａｃｃｔｔｃｃａｇａａａａｃ ｇａｔｃｔｔａｇａａａａｃｔｇｔｇｃａａｃｔａｔ９８ＴｈｒＣｙｓＬｙｓＴｙｒ　ＬｅｕＰｒｏＧｌｕＡｓｎＡｓｐＬｅｕＡｒｇＬｙｓＬｅｕＣｙｓＡ ｓｎＴｙｒ１５２０２５ｇｔｔａｃｇｇａｇｔｔｇｔｔｇａｔｔｇａａｇａｇｔｇｃａａｔｇｔｇｃａａｃｃａｇｔｔｔｃｔｔｔｔ１４６ＶａｌＴｈｒ ＧｌｕＬｅｕＬｅｕＩｌｅＧｌｕＧｌｕＣｙｓＡｓｎ　ＶａｌＧｌｎＰｒｏＶａｌＳｅｒＰｈｅ３０３５４０ｃｃｔｇｔａａｃｃａｔａｔｇｔｇｇｔｇ ａｔａｔｔｃａｔｇｇａｃａｇｔｔｃｔａｃｇａｔｃｔｔｔｔｇ１９４ＰｒｏＶａｌＴｈｒＩｌｅＣｙｓＧｌｙＡｓｐＩｌｅＨｉｓＧｌｙＧｌｎＰｈｅＴｙｒ　 　ＡｓｐＬｅｕＬｅｕ　４５５０５５ｃａｇｔｔａｔｔｔｃｇｔｃｇａｇｇａｇｇａａａａｃｔｇｃｃｇｇａｃａａａａａｔｔａｔａｔａｔｔｔ２４２ Ｇｌｎ　ＬｅｕＰｈｅＡｒｇＡｒｇＧｌｙＧｌｙＬｙｓＬｅｕＰｒｏＡｓｐＬｙｓＡｓｎＴｙｒＩｌｅＰｈｅ６０６５７０７５ａｔｇｇｇｇｇａｔｔｔｔ　 　ｇｔｔｇａｔｃｇｇｇｇｔｔａｔｔａｃａｇｃｃｔｃｇａａ　ａｃｃｃｔｃａｃａ２９０ＭｅｔＧｌｙＡｓｐＰｈｅＶａｌＡｓｐＡｒｇＧ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林矫矫，姚利晓，傅志强，刘金明，朱传刚，冯新港，苑纯秀，蔡幼民，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所，农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海动物生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]