超氧化物歧化酶组合物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）组合物及其制备方法，以及一种从动物血液，尤其是牛血中提取超氧化物歧化酶并进行聚乙二醇修饰的方法。本发明专利技术的组合物，可有效地清除人体内过多的氧自由基、增强人体的免疫功能、预防疾病、延缓衰老。本发明专利技术组合物还可以有效地清除血管壁胆固醇的沉积、降低血液粘度、防止和延缓动脉硬化、狭窄和堵塞，使该组合物中的维生素Ｃ和维生素Ｅ更易于被人体吸收和储存，从而最大限度地满足人体的需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种超氧化物歧化酶(SOD)组合物及其制备方法，以及一种从动物血液，尤其是牛血中提取超氧化物歧化酶并对其进行聚乙二醇修饰的方法。
技术介绍
超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动植物及微生物中，具有催化超氧阴离子歧化反应的金属酶，分别含有Cu、Zn、Mn、Fe、Co等金属元素，具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、增强人体免疫力的功能，被誉为人体内的垃圾清道夫。临床上主要用于延缓人体衰老、防治色素沉积、消除局部炎症。特别用于治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后出现的炎症。超氧化物歧化酶因其无抗原性，毒副作用较小，所以被认为是很有临床价值的治疗酶。不仅如此，近年来，超氧化物歧化酶还成为日用化工产品和保健食品行业的重要添加剂。超氧化物歧化酶的制备方法随原料而异。目前国内外制备超氧化物歧化酶的原料有动物血液、微生物和动植物组织。由于超氧化物歧化酶的生物半衰期短，且具有异体蛋白免疫原性和患者不易吸收利用等缺点，因此其临床应用受到了限制。通过使用聚乙二醇对天然超氧化物歧化酶进行共价交联修饰，降低、甚至消除了天然超氧化物歧化酶免疫原性，生物半衰期由此得以延长。迄今为止，动物血液是提取制备超氧化物歧化酶的主要原料。从动物血液中制备超氧化物歧化酶的方法已有报导，其基本工艺流程为对于动物血液进行预处理，洗涤红细胞和溶血；用有机溶剂去除大部分杂蛋白得超氧化物歧化酶粗制品；再经柱层析分离得到成品。但是这些方法普遍存在处理量小、纯化效率低、周期长等缺陷。本专利技术所述制备超氧化物歧化酶的方法，克服了上述缺陷，而且适用于大规模工业化生产。含有超氧化物歧化酶作为活性成分的组合物也有少量报导，但研制新的、用途更为广泛和更为有效的超氧化物歧化酶组合物一直是本领域技术人员努力的目标。
技术实现思路
本专利技术人在进行多次筛选和大量实验后惊奇地发现，当将过氧化物歧化酶、维生素C(VC)、维生素E(VE)、蜂胶按照以下特定比例制成本专利技术组合物时，其各有效成分能在人体内靶向定位，清除过剩自由基，免除细胞损伤，从而阻断疾病的发生与发展，保护生命大分子(基因)，延缓衰老，而且没有副作用，且可改善患者因长期依赖药物的累积性毒副作用并降低用药量与标准，大幅度提高生命质量。此外，本专利技术所述组合物中各有效成分具有协同作用，其对于人体内过剩自由基的清除作用明显优于各组分单独使用时作用之和。同时可以有效地清除血管壁胆固醇的沉积，恢复和提高高血脂患者的血清高密度脂蛋白，有效降低血液粘度，防止和延缓动脉硬化、狭窄和堵塞，使蜂胶和螺旋藻中的营养成分更易于被人体吸收和储存。本专利技术的超氧化物歧化酶组合物含有超氧化物歧化酶、维生素C(VC)、维生素E(VE)、蜂胶。此外，本专利技术组合物还可以含有螺旋藻。其中，每百克本专利技术组合物中含有600,000-1,200,000U的超氧化物歧化酶，组合物中维生素C、维生素E和蜂胶的重量比为5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0。优选的本专利技术组合物含有75,000-96,000U的超氧化物歧化酶，维生素C、维生素E和蜂胶的优选重量比为5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7。当本专利技术组合物中含有螺旋藻时，维生素C、维生素E、蜂胶与螺旋藻的重量比为5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0∶3.5-5.1，优选5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7∶3.8-4.4。本专利技术的超氧化物歧化酶组合物可以按照以下方法制备1.过筛与灭菌取蜂胶过筛并灭菌；2.称量按比例称取超氧化物歧化酶、维生素C、维生素E、灭菌后的蜂胶和螺旋藻(在使用螺旋藻时)；3.原料混合与包装将称量好的上述原料按照维生素E、超氧化物歧化酶、蜂胶、维生素C、螺旋藻(在使用螺旋藻时)的添加顺序在三维混料机中进行充分混合，然后按需要进行包装。本专利技术的超氧化物歧化酶组合物的服用量为每公斤体重0.02g，每日2次。另外，本专利技术提供了一种从动物血液，尤其是牛的血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其具体步骤为1.制备抗凝血向新鲜的动物血液，优选牛的血液中加入抗凝剂柠檬酸三钠溶液；2.分离洗涤红细胞将抗凝血在常温下离心4-6分钟，优选5分钟，去除上层黄色液体，收集下层的红细胞，生理盐水洗涤两次；3.溶血，破碎将步骤2所得红细胞中加入适量去离子水，剧烈搅拌使所述红细胞溶血破碎；4.去除血红蛋白加入相当于步骤3所得溶血溶液0.2-0.3倍，优选0.25倍量的乙醇和0.05-0.15倍，优选0.1倍量的氯仿，搅拌使得血红蛋白反应沉淀，离心除去血红蛋白沉淀；5.超氧化物歧化酶粗产物的制备将步骤4制得的乙醇-氯仿上清液中加入1-3倍，优选2倍量的丙酮，高速离心收集沉淀物；6.热变将步骤5中所得的沉淀物准确称量，按超氧化物歧化酶磷酸钾缓冲液1∶10-14，优选1∶12的重量比加入磷酸钾缓冲液(所述磷酸钾缓冲液按1000ml去离子水加入5.9g磷酸氢二钾和2.2g磷酸二氢钾配制而成)，加热该溶液使其温度快速升至55-62℃，优选60℃，然后再快速使其温度降至15℃以下，高速离心收集上清液后加入1.5-2.5倍，优选2倍量的丙酮，高速离心收集沉淀物；7.去除杂蛋白准确称量步骤6制得的沉淀并向其中加入4-6倍，优选5倍量的所述磷酸钾缓冲液，搅拌至其彻底溶解。高速离心收集上清液，加入1.5-2.5倍，优选2倍量的丙酮，高速离心收集下层沉淀；8.除盐、浓缩向步骤7所得沉淀物中加入去离子水，搅拌至彻底溶解，离心收集上清液，加入该上清液1.5-2.5倍量的丙酮，离心收集下层沉淀，所述沉淀与去离子水的比例优选1∶1；9.将步骤8所得沉淀加入去离子水，混合后真空冷冻干燥。根据本专利技术的上述方法所制得的超氧化物歧化酶的比活为3600-9000u/mg本专利技术还提供了一种使用聚乙二醇(PEG)对超氧化物歧化酶进行修饰的方法，该方法包括以下步骤1.聚乙二醇的活化(1)向二氧六环中依次和混和加入聚乙二醇、丁二酸钾；所得溶液水浴中充分加热搅拌，然后冰浴冷却搅拌该溶液； (2)向所得溶液中加入乙醚，离心后去除乙醚；(3)向去除乙醚后的残余物中二氯甲烷，搅拌溶解后离心分离出上清液；(4)向所得上清液中加入无水乙醚，离心分离收集沉淀；(5)将所得沉淀冻干后，加入二甲基甲酰胺和羟基琥珀酰亚胺，搅拌过夜；(6)加入无水乙醚，离心分离出沉淀，将该沉淀冻干。2.将步骤1所得冻干后的沉淀和超氧化物歧化酶按比例于双蒸水中充分混合，低温过夜后，真空冷冻干燥。其中，优选在下述条件下进行过氧化物歧化酶的聚乙二醇修饰1.聚乙二醇的活化(1)将聚乙二醇、丁二酸钾加至二氧六环中，所述各物质的比例为二氧六环∶聚乙二醇∶丁二酸钾1000∶400-800∶10-50(ml∶g∶g)。所得溶液放入90℃水浴锅中搅拌1小时，然后冰浴冷却搅拌；(2)按前述二氧六环4-6倍量加入乙醚，离心10分钟后去除乙醚；(3)向去除乙醚后的残余物中按前述二氧六环1-2倍量加入二氯甲烷，搅拌溶解后离心分离15分钟，分离出上清液；(4)按前述二氧六环4-6倍量向所得上清液中加入无水乙醚，离心分离15分钟，离心分离收集沉淀；(5)将所得沉淀冻干后，按前述二氧六环1-3倍量加入二甲基甲酰胺，同时按每100ml二甲基甲酰胺加入0.050-0.075g羟基琥珀酰亚胺的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超氧化物歧化酶组合物，该组合物含有超氧化物歧化酶、维生素Ｃ、维生素Ｅ和蜂胶，其中每百克组合物中含有６００，０００－１，２００，０００Ｕ的超氧化物歧化酶，其中，维生素Ｃ、维生素Ｅ和蜂胶的重量比为５．２－７．３∶４．１－５．２∶４．１－５．０；优选每百克该组合物含有７５，０００－９６，０００Ｕ的超氧化物歧化酶，维生素Ｃ、维生素Ｅ和蜂胶的重量比为５．９－６．４∶４．３－４．５∶４．４－４．７。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙龙祥，
申请(专利权)人：孙龙祥，
类型：发明
国别省市：22[中国|吉林]