用核移植制备产组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因山羊的方法技术

利用山羊奶蛋白β－酪蛋白的调控序列调控改构的人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因（ｔ－ＰＡｍ）在转基因山羊的乳腺表达。构建随机整合载体（ｐＧＢＣＮ－ｔＰＡｍ和ｐＧＢＣ２－ｔＰＡｍ）和β－酪蛋白基因打靶载体（ｐＧＢＣ４－ｔＰＡｍ）。在构建中利用了来自关中奶山羊的β－酪蛋白调控序列和３’端序列，考虑到用于细胞转染，在载体的３’端也连接了ｎｅｏ↑［ｒ］基因。在本发明专利技术中包括使用这三种载体转染奶山羊胎儿成纤维细胞，利用体细胞核移植技术对随机整合和同源重组的阳性细胞进行克隆以得到新的山羊个体，此山羊所携带的人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因能在β－酪蛋白基因调控序列的指导下表达，从而在山羊的乳腺里分泌人组织型纤溶酶原激活剂突变体。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
利用核移植制备产组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因山羊的方法，包括以下步骤：（１）奶山羊的β－酪蛋白基因５’端和３’端序列克隆与鉴定；（２）随机整合山羊细胞的乳腺表达载体的构建；（３）基因打靶载体的构建；（４） 分离培养奶山羊胎儿成纤维细胞；（５）转染奶山羊胎儿成纤维细胞；（６）随机整合与同源重组的细胞鉴定；（７）核移植和胚胎的激活与体外培养；（８）转基因山羊及乳腺表达产物的鉴定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈伟，杨正田，邓继先，潘庆杰，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]