一种利用气相色谱‑质谱分析方法同时检测酮糖和氨基糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用气相色谱‑质谱分析方法同时检测酮糖和氨基糖的方法。该方法通过乙硫醇‑三氟乙酸和六甲基二硅胺烷‑三甲基硅烷体系对样品以及混合单糖标准品溶液中的酮糖和氨基糖进行硫醇化以及硅醚化衍生，反应产物经二氯甲烷或三氯甲烷萃取后，有机层通过GC‑MS进行检测，以不同浓度的混合单糖标准品溶液的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，以每种单糖的浓度为横坐标建立标准曲线，用内标法定量样品溶液中单糖的含量。该方法具有专属性强、重复性好、分离度好，结果可靠等优点，可以实现对中药中酮糖和氨基糖的检测和定量。此外，该方法亦可检测葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖和木糖。

Simultaneous determination of ketone and amino sugar by using a gas chromatography mass spectrometry

The invention discloses a method using gas chromatography mass spectrometry method for simultaneous detection of ketones and amino sugar. The three ethanethiol trifluoroacetic acid and six methyl two silizane three methyl silane system and silicon etherification of mercaptan samples and mixed monosaccharides in standard solution ketones and amino sugar derivatives, reaction products with dichloromethane or chloroform extraction, the organic layer was detected by GC MS to peak the area of mixed standard solution with different concentrations of monosaccharides and internal standard peak area ratio as the ordinate, with the concentration of each monosaccharide as abscissa to establish the standard curve, the content of standard monosaccharide quantitative method in the sample solution in use. The method has the advantages of strong specificity, good repeatability, good separation and reliable results, and can be used to detect and quantify ketone sugar and amino sugar in traditional Chinese medicine. Besides, this method can also detect glucuronic acid, galactohydric acid, glucose, galactose, mannose, Li Tang, fucose, Arabia sugar and xylose.

【技术实现步骤摘要】
一种利用气相色谱-质谱分析方法同时检测酮糖和氨基糖的方法
本专利技术涉及一种检测酮糖和氨基糖的方法，特别涉及一种利用气相色谱-质谱分析方法同时检测酮糖和氨基糖的方法。本专利技术属于化学分析及检测

技术介绍
GC-MS(GasChromatograph-MassSpectrometer)，为气相色谱和质谱联用技术。GC-MS利用气相色谱作为质谱的进样系统，使复杂的化学组会得到分离；利用质谱仪作为检测器进行定性和定量的分析。供试品经GC分离为单一组分，按其不同的保留时间，与载气同时流出色谱柱，经过分子分离器接口，除去载气，保留组分进入MS仪离子源被离子化，样品组分转变为离子，经分析检测，记录为MS图。GC-MS中气相色谱仪相当于质谱仪进样系统，而质谱仪则是气相色谱的检测器，通过接口将二者有机地结合。GC-MS法现已广泛用于药物滥用监测、兴奋剂检测、临床疾病诊断、药动学研究等体内药物分析。虽然现有技术中公开了GC-MS检测法通过乙硫醇-三氟乙酸和六甲基二硅胺烷-三甲基硅烷体系对单糖和糖醛酸进行衍生。但是，目前该方法没有应用到氨基糖和酮糖。本专利技术首次采用乙硫醇-三氟乙酸和六甲基二硅胺烷-三甲基硅烷体系对酮糖和氨基糖进行衍生，GC-MS检测，并通过单因素考察实验对衍生试剂条件进行了优化。并将该方法应用于中药中游离酮糖和氨基糖的检测，为中药的进一步深入研究奠定理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过利用气相色谱-质谱分析方法(GC-MS检测法)同时检测糖酮糖和氨基糖的方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种利用气相色谱-质谱分析方法同时检测酮糖和氨基糖的方法，该方法通过乙硫醇-三氟乙酸和六甲基二硅胺烷-三甲基硅烷体系对样品以及混合单糖标准品溶液中的单糖进行硫醇化以及硅醚化衍生，制备得到酮糖和氨基糖的乙硫醇-硅醚化衍生产物，反应产物经二氯甲烷或三氯甲烷萃取后，有机层通过气相色谱-质谱分析方法(GC-MS)进行检测，以不同浓度的混合单糖标准品溶液的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，以每种单糖的浓度为横坐标建立标准曲线，用内标法定量样品溶液中的酮糖和氨基糖及其他单糖的含量，所述的混合单糖标准品溶液中至少包括一种酮糖及一种氨基糖。衍生后的反应产物经二氯甲烷或三氯甲烷溶液萃取，有机层含有可被GC-MS检测的酮糖和氨基糖的乙硫醇-硅醚化衍生产物，因此可以检测现有方法无法检测的氨基糖。其中，优选的，所述的气相色谱-质谱的色谱条件为：采用Agilent7890A-5975C气质联用仪，采用DB-5毛细管柱，程序升温，柱温80℃，以2.5℃/min至190℃，以2℃/min至252℃，以250℃/min至300℃，氦气作载气，进样口温度250℃，柱流速1.2mL/min，EI(70eV)，接口温度250℃，离子源温度230℃，扫描范围:m/z50-550，扫描率:2.5scan/s。其中，优选的，通过乙硫醇-三氟乙酸和六甲基二硅胺烷-三甲基硅烷体系对酮糖和氨基糖进行硫醇化以及硅醚化衍生的具体操作步骤为：量取相同体积的样品溶液以及混合单糖标准品溶液，分别浓缩至干，加入乙硫醇和三氟乙酸的混合溶液，20-25℃密封进行硫醇化反应10-50min，通风橱内自然挥干；加入吡啶溶解，再加入六甲基二硅胺烷以及三甲基氯硅烷，50-90℃水浴，进行硅醚化反应10-50min，反应后，加入二氯甲烷或三氯甲烷的水溶液，振荡，离心，取下层有机层溶液，可直接进行气相色谱-质谱分析。其中，优选的，硫醇化反应的时间为10min。其中，优选的，乙硫醇和三氟乙酸的体积比为2:1。其中，优选的，六甲基二硅胺烷与三甲基氯硅烷的体积比为3:1。其中，优选的，加入六甲基二硅胺烷和三甲基氯硅烷后，70℃水浴，进行硅醚化反应30min。其中，优选的，所述的内标为赤藓醇。其中，优选的，所述的混合单糖标准品溶液中还包含中性糖及/或糖醛酸；所述的其他单糖包括中性糖及/或糖醛酸。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术改进了现有的衍生方法，并对衍生条件进行了单因素的优化，样品经过乙硫醇-三氟乙酸和六甲基二硅胺烷-三甲基硅烷体系对酮糖和氨基糖进行衍生，反应产物经二氯甲烷或三氯甲烷萃取，有机层含有可被GC-MS检测的酮糖和氨基糖的乙硫醇-硅醚化衍生产物，因此可检测出现有方法无法测定的氨基糖，而酮糖和氨基糖的检测，一直缺乏专属性的方法。(2)本专利技术采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，应用分析物中的正构烷烃对单糖保留指数(RI)进行了测定，证实了保留指数可以对酮糖和氨基糖做很好的定性分析。(3)本专利技术的方法亦可检测中性糖和糖醛酸，构建了强大的多种单糖组成检测方法。每种单糖均为单一高响应的色谱主峰，具有专属性强、重复性好、分离度好，结果可靠等优点。(4)本专利技术方法可以实现对中药中酮糖和氨基糖的检测和定量，同时也可以用于检测中药中游离的酮糖。此外，该方法亦可检测中性糖及糖醛酸，例如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖和木糖。附图说明图1为硫醇化衍生反应时间对峰面积的影响；图2为硫醇化衍生试剂总量对峰面积的影响；图3为硅醚化衍生试剂反应温度对峰面积的影响；图4为硅醚化衍生试剂剂量对峰面积的影响；图5为标准品GC-MS色谱图(无二氯甲烷/三氯甲烷萃取)；图6为标准品GC-MS色谱图(二氯甲烷/三氯甲烷萃取)；图7为样品GC-MS色谱图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术做进一步的说明验证，所有实施例仅用于例证本专利技术，不限制本专利技术的保护范围。本领域技术人员知晓对于本专利技术权利要求内所做的更改或等效变更，均落入本专利技术的保护范围之内。实施例1检测糖酮糖和氨基糖的GC-MS方法的建立1.仪器与试剂Agilent7890A-5975C气质联用仪，配备DB-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)；标准单糖：果糖(Fru)、氨基葡萄糖(GlcN)、氨基半乳糖(GalN)、氨基甘露糖(ManN)(sigma公司)；知母纯化多糖(本实验室提取纯化)；六甲基二硅胺烷(上海试一化学试剂有限公司)；三甲基氯硅烷(上海化学试剂采购供应五联化工厂)；吡啶(天津市光复科技发展有限公司)；三氟乙酸(天津市光复精细化工研究所)；乙硫醇(石家庄冀石化工有限公司)；赤藓醇(北京索莱宝科技有限公司)。2.实验方法与结果2.2实验方法的优化2.2.1文献方法制备溶液精密称取四种标准单糖样品，各3mg，加入1mL水溶解。取100μL混合溶液，氮气吹干。加入100μL乙硫醇和三氟乙酸的混合溶液(体积比2:1)，室温，密封，进行硫醇化反应10min，氮气吹干。加入100μL吡啶溶解，再加入132μL六甲基二硅胺烷和44μL三甲基氯硅烷试剂，70℃水浴，进行硅醚化反应30min。反应后，加入100μL水，振荡，离心，取上层溶液，可直接进行气相色谱分析。2.2.2改进方法制备溶液精密称取四种标准单糖样品，各3mg，加入1mL水溶解。取100μL混合溶液，浓缩至干。加入100μL乙硫醇和三氟乙酸的混合溶液(体积比2:1)，室温，密封，进行硫醇化反应10min，通风橱内自然挥干。加入100μL吡啶溶解，再加入132μL六甲基二硅胺烷和44μL三甲基氯硅本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用气相色谱‑质谱分析方法同时检测酮糖和氨基糖的方法，其特征在于，该方法通过乙硫醇‑三氟乙酸和六甲基二硅胺烷‑三甲基硅烷体系对样品以及混合单糖标准品溶液中的单糖进行硫醇化以及硅醚化衍生，制备得到酮糖和氨基糖的乙硫醇‑硅醚化衍生产物，反应产物经二氯甲烷或三氯甲烷萃取后，有机层通过气相色谱‑质谱分析方法(GC‑MS)进行检测，以不同浓度的混合单糖标准品溶液的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，以每种单糖的浓度为横坐标建立标准曲线，用内标法定量样品溶液中的酮糖和氨基糖及其他单糖的含量，所述的混合单糖标准品溶液中至少包括一种酮糖及一种氨基糖。

【技术特征摘要】
1.利用气相色谱-质谱分析方法同时检测酮糖和氨基糖的方法，其特征在于，该方法通过乙硫醇-三氟乙酸和六甲基二硅胺烷-三甲基硅烷体系对样品以及混合单糖标准品溶液中的单糖进行硫醇化以及硅醚化衍生，制备得到酮糖和氨基糖的乙硫醇-硅醚化衍生产物，反应产物经二氯甲烷或三氯甲烷萃取后，有机层通过气相色谱-质谱分析方法(GC-MS)进行检测，以不同浓度的混合单糖标准品溶液的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，以每种单糖的浓度为横坐标建立标准曲线，用内标法定量样品溶液中的酮糖和氨基糖及其他单糖的含量，所述的混合单糖标准品溶液中至少包括一种酮糖及一种氨基糖。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的气相色谱-质谱的色谱条件为：采用Agilent7890A-5975C气质联用仪，采用DB-5毛细管柱，程序升温，柱温80℃，以2.5℃/min至190℃，以2℃/min至252℃，以250℃/min至300℃，氦气作载气，进样口温度250℃，柱流速1.2mL/min，EI(70eV)，接口温度250℃，离子源温度230℃，扫描范围:m/z50-550，扫描率:2.5scan/s。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过乙硫醇-三氟乙酸和六甲基二硅胺烷-三甲基硅烷体系对酮糖和氨基糖进行硫醇化以及硅醚化衍生的具...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏永刚，梁军，王天龙，孙慧敏，
申请(专利权)人：夏永刚，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23