通过体胚发生途径建立地锦再生体系的方法技术

本发明专利技术涉及以地锦成熟胚为材料建立其再生体系的方法，包括三个培养阶段：（１）成熟胚切块培养诱导愈伤组织；（２）愈伤组织继代培养；（３）愈伤组织中体细胞胚的发生和体细胞胚发育成植株。在继代培养中采用分步降低２，４－二氯苯氧乙酸浓度的方法，使体细胞胚的发生率高达５３％，可作为地锦遗传转化体系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及地锦离体培养再生体系建立的方法。具体讲涉及以地锦种子成熟胚为外植体，通过体细胞胚胎发生途径建立其再生体系的方法。属于植物细胞工程领域。
技术介绍
地锦为葡萄科(Vitaceae)地锦属(Parthenocissus)，又名爬山虎，是落叶藤本植物，有强大的吸附和攀缘能力。地锦是具有良好观赏效果的园林、城市垂直绿化、美化植物。联合国生物圈和环境组织提出“城市绿地面积达到60m2/人时为最佳居住环境”，人类视野中绿色占25％以上时视觉感觉最舒服。但我国城市人均绿地面积不到5m2，与发达国家水平相距甚远，绿化用地缺乏是主要问题之一，而绝大多数城市建筑墙面未加以充分利用，荒漠、石质山地的植被恢复，新建公路、铁路创伤面及护坡的植被建设均需要特殊功能植物。地锦是解决上述问题的优选植物种类之一。在城市绿化中地锦适应墙面辐射的高温，对氯气抗性强，夏季地锦爬满墙壁对墙面有显著的降温增湿效果，减少墙壁热辐射的面积，有效地消除部分热污染源，并且地锦种植在建筑物墙根处，占用绿化土地面积小，既达到了绿化效果，又弥补了城市绿地不足。地锦增加了城市中植物光合作用的面积，提高了光合效率，从而吸收、固定了温室气体，从根本上减弱了“热岛效应”，同时地锦具有一定的耐荫性，可在高架路下立柱等较荫处作为垂直绿化材料。地锦还是一种优美的攀摄植物，枝繁叶茂，层层密布，入秋叶色变红，有很好的景观效果。地锦适应性强，对土质要求不严，无论是种子繁殖、插条、分株都容易成活；生长迅速，一年生苗株高可达1.5-2.0m，茎长20-50m；耐瘠薄，一般无病虫害。同属的异叶爬山虎、绿爬山虎和美国爬山虎都有较好的绿化山体断面的效果，其自然生境多为山坡、沟边灌丛或疏林中以及攀援树上、岩石上，生长地海拔最低为140m，最高可达1760m。地锦属植物较强的适应性，使其成为绿化荒漠的先锋植物。随着国家对生态环境建设的日益重视，地锦属植物大量用于荒山绿化、固土护坡，防止水土流失以及干旱地区地面覆盖和植被恢复。地锦在土石荒山与石质荒山、黄土高原、风沙地、长江流域红、黄壤水土流失区绿化中已经应用。地锦还适宜光滑岩面配置，种植后，不需采取任何防护和辅助措施，即可布满岩面，达到绿化美化效果，预示了地锦在荒漠绿化中广阔的应用前景。然而地锦在冬季落叶，缺乏绿意，在降雨400mm以下，就难生存，限制了其绿化效果和范围，因此通过育种手段培育绿期长、耐干旱的地锦新品种可显著增强其绿化价值。同时地锦的优良特性并不是都存在于每一个种中，以原产中国的地锦(Parthenocissus tricuspidata)和原产美国的五叶地锦(P.quinquefolia)所含优良特性为多。地锦吸盘发达，附着力强，但生长较慢，五叶地锦生长快、抗性强，但吸盘不发达，附着力弱，这些性状限制严重影响了地锦的推广应用，培育兼具两者优点的新品种将摆脱这一限制。但到目前为止对地锦的利用还处于自然式的随机应用状态，有目标的育种工作尚未开展。建立高频、稳定的植株再生体系是利用现代生物技术进行品种改良的前提。植株再生体系是外源基因的良好受体，同时也是体细胞融合的基础。深入研究爬山虎体细胞胚的发生还将为爬山虎原生质体培养、优良无性系的繁殖和突变体筛选等研究奠定基础。因此，地锦高频、稳定再生体系的建立成为生物技术育种的关键。有关地锦属植物植株再生的研究工作仅有少量报道。冯大领等(北京林业大学学报，2004，26(4)，97-100)以地锦子叶的叶片和叶柄为试验材料，在MS附加6-BA0.3mg/L和NAA0.1mg/L培养基上或1/2MS附加6-BA0.5mg/L和NAA0.1mg/L培养基上诱导产生体细胞胚，转移到无植物生长调节剂的MS或B5培养基上发育成正常植株。并进行了组织学观察，发现地锦体细胞胚的形成经历了球形胚、心形胚、鱼雷胚、于叶胚等几个阶段，与合子胚的发育途径相似，但存在诱导率较低的问题，诱导率仅为16.7％。本专利技术人之一(李正红等，林业科学研究，2005，1)对地锦盛花期后45天的幼胚在添加2，4-D和6-BA的B5培养基进行愈伤诱导，通过对诱导出的生长较快、灰白色无粘性、质地稀软的愈伤组织继代培养，继代培养基为B5+6-BA+NAA+LH，得到黄绿色颗粒状松散的胚性愈伤组织，转移到胚状体分化培养基B5+6-BA+NAA+LH后，分化出胚状体并再生出地锦植株，但胚状体分化率较低，只有33％。虽然通过以上方法建立了地锦再生体系但再生率较低，同时外植体的取材受季节限制大，因此在实际应用中受到了极大的限制。在地锦离体培养的各种外植体中，其种子比其他外植体具有易收集、耐贮藏，取材不受季节限制等优势，且种子中成熟胚内源激素含量高，细胞具有潜在旺盛的分裂能力，是用于离体培养的良好材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立地锦的高频再生体系。本专利技术是以地锦成熟胚为外植体进行培养，以此建立地锦再生体系的方法。本专利技术通过离体培养地锦成熟胚建立了高频的再生体系，所获得的再生植株性状均一、稳定，易于遗传工程操作。本专利技术的培养方法包括三个培养阶段(1)成熟胚切块培养诱导愈伤组织(2)愈伤组织继代培养(3)愈伤组织诱导体细胞胚和体细胞胚发育成植株，培养基中均含有蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，培养温度22～28℃，光暗周期16h/8h，光强2000～2500勒克斯，相对湿度60％-70％，每培养30天更换一次新鲜培养基。本专利技术三个阶段的基本培养基是改良B5培养基(表一)，在第(1)阶段培养中所用激素为1.0mg/l-3.0mg/l6-苄基氨基腺嘌呤6-BA，100mg/L-1000mg/l水解乳蛋白LH，0.5mg/l-6.0mg/l2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，在第(2)阶段的培养基中所用激素为0.5mg/l-3.0mg/l 2，4-D，0.1mg/l-3.0mg/l6-BA，在第(3)阶段的培养基中所用激素为0.1mg/l-3.0mg/l6-BA、0.1mg/l-3mg/l奈乙酸NAA、100mg/l-1000mg/l LH、0.1mg/l-10.1mg/l赤霉酸AC。优选为第(2)阶段培养在含激素为1.5mg/l-2.5mg/L 2，4-D，0.5mg/l-1.5mg/l 6-BA的培养基上愈伤组织继代三次，在第(3)阶段的培养基从A.含500mg/L水解乳蛋白LH的培养基B.含激素2mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、300mg/LLH的培养基C.含激素2mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、100mg/L LH、5mg/l AC的培养基三种培养基中选择其一。本专利技术特别优选的方法包括以下步骤(1)成熟胚切块接种于添加3.5mg/L-4.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1.5mg/L-2.5mg/L6-苄基氨基腺嘌呤6-BA和500mg/l水解乳蛋白LH的培养基上；(2)诱导得到的愈伤组织第一次继代培养于1.5-2.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-苄基氨基腺嘌呤0.5-1.56-BA的培养基上；第二次继代培养于0.5-1.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-苄基氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L 6-BA的培养基上；第三次继代培养于0.5-1.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立地锦高频再生体系的方法，其特征在于以地锦成熟胚为外植体，进行培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙振元，李正红，江泽慧，巨关升，韩蕾，刘会超，杨学军，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]