轮状病毒VP6蛋白的一种编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了轮状病毒ＶＰ６蛋白的一种编码基因及其应用。本发明专利技术的目的是提供在双子叶植物中，特别是在苜蓿中具有较高表达量的轮状病毒ＶＰ６蛋白的一种编码基因及用该编码基因生产轮状病毒口服疫苗的方法及得到的轮状病毒口服疫苗。本发明专利技术所提供的轮状病毒ＶＰ６蛋白编码基因，具有下述核苷酸序列之一：１）序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１的ＤＮＡ序列；２）序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：２的ＤＮＡ序列；３）在高严谨条件下可与序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１或ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：２限定的ＤＮＡ序列杂交的核苷酸序列；４）与序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１或ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：２限定的ＤＮＡ序列具有８０％以上同源性，且在双子叶植物中具有较高表达量的ＤＮＡ序列。本发明专利技术的轮状病毒口服疫苗能够用于预防多种轮状病毒感染引起的婴幼儿和幼龄牲畜的急性腹泻。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及轮状病毒VP6蛋白的一种编码基因及其应用，特别涉及利用该编码基因生产轮状病毒口服疫苗的方法及得到的轮状病毒口服疫苗。
技术介绍
轮状病毒的感染在人类、哺乳动物、鸟类中普遍存在，是病毒性腹泻的主要病原物。轮状病毒分为7个组(A-G)，其中A组轮状病毒是引起婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要原因，在世界范围内广泛流行。无论发达国家还是发展中国家，90％以上的婴幼儿在3岁之前都受到了轮状病毒的感染。在发展中国家，每年大约有一千八百万儿童因感染轮状病毒住院，其中约一百万人死亡，造成巨大的经济损失(Dodet etal.1997)，在我国婴幼儿死因中居第二位。另外，轮状病毒也是幼龄牲畜(牛、羊、猪)致死的重要原因之一。犊牛感染多发生于3天-15周龄，病死率可达50％，有的并发肺炎，致死率升高。缺乏母源抗体保护的仔猪，在出生一周内发病率较高，病死率高达100％。由此可见，诱导被动免疫对于研制轮状病毒疫苗显得尤其重要。轮状病毒属于呼肠孤病毒科，其基因组为双链RNA，包括11个基因片段。每个片段含一个开放读码框架，分别编码6个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和5个非结构蛋白(NSP1-NSP5)。轮状病毒的外壳分为三层，最外层由VP4和VP7构成，中间层由VP6构成，内层由VP2构成(Raming R F，Annu.Rev.Microbiol.，1997，51225-255)。VP4和VP7可以诱导机体产生中和性抗体，决定轮状病毒的血清型，是主要的种属特异性抗原，利用VP4和VP7制成的疫苗不能产生交叉保护。VP6是组或亚组特异性抗原，占病毒颗粒的51％，VP6蛋白诱导机体产生的抗体具有很强的交叉反应性，表达VP6蛋白的疫苗能够提供异源保护作用。VP6蛋白虽然不能刺激机体产生中和性抗体，但是它能够增强同源和异源的VP4和VP7蛋白的免疫原性，提高中和抗体水平(Esquivel FR，et.al.Arch.Virol.，2000，145813-825)。Feng N等人(J.Clin.Invest.，2002，1091203-1213)的研究结果表明VP6抗体IgA在体内通过抑制病毒复制过程中的早期转录实现对机体的保护作用。因此，在研制轮状病毒疫苗时可以将VP6蛋白作为候选蛋白来生产高效的人畜共用疫苗。1998年美国FAD批准使用人一猴轮状病毒四价重配疫苗(RRV-TV)，该疫苗对重症腹泻保护性较好，对普通腹泻的阻断效果在70％左右，但1999年因为发现引起婴幼儿肠套叠而被停止使用(Centers for Disease Control.MMWR，1999，48577-581)。尽管现在正在研制的亚单位疫苗和DNA疫苗在国外已经获得专利授权，但因为存在制备工艺、安全性、生产成本等问题，目前均未上市。表达人轮状病毒VP7的非复制性的重组腺病毒于2002年在国内申请专利(申请号02104125.3)。由于VP7是种属特异性抗原，以一种血清型的VP7制成的疫苗往往不能使机体产生抵抗其它血清型的轮状病毒的能力，因为轮状病毒在不同的地区存在不同的血清型，所以，这种疫苗不利于大面积推广。利用植物作为生物反应器生产可食用疫苗在生物
开辟了一条新途径。1992年，Mason等(Proc Natl Acad Sci USA，1992，8911745-11749)提出了用转基因植物生产疫苗的新思路，迄今为止，已经有多种病毒和细菌抗原在植物中表达用以生产口服疫苗。轮状病毒经肠道粘膜感染且繁殖局限在肠道，因此诱导局部保护性粘膜免疫是研制轮状病毒疫苗的关键所在。应用转基因植物生产可食用疫苗具有巨大的潜力，因为它不仅能够诱导机体产生分泌型的黏膜IgA，还是一个生产抗原蛋白的廉价系统。有研究表明，口服途径比其他非肠道途径更易于诱导黏膜免疫，利用转基因植物生产的抗原蛋白到达肠道后被肠道淋巴上皮中特殊的抗原捕捉细胞—M细胞(microfold cell)识别并转运，进一步在抗原呈递细胞和T细胞的协助下，激活B细胞并释放分泌型IgA(sIgA)。sIgA与黏膜内的可溶性抗原、细菌、病毒等结合后，可能封闭了它们与M细胞上的受体相结合的位点，从而阻止其进入机体；另外，sIgA还可经血液循环进入小肠上皮细胞，对正在感染上皮细胞的病毒发挥拦截作用。所以，黏膜IgA不仅能够抵抗那些定殖在黏膜表面的微生物，还能抵抗那些经过黏膜表面进入机体但却引起系统性疾病的病原微生物(Lamm M E，Annu Rev Microbiol，1997，51311-340)。2000年，O’Brien G J等(Virology，2000，270444-453)利用病毒载体在烟草中表达了轮状病毒VP6蛋白且在植物体内成功装配成病毒颗粒。2002年，Matsumura，T.等(Arch Virol，2002，1471263-1270)应用农杆菌介导的转化系统在转基因马铃薯中表达了牛轮状病毒VP6基因。2003年Yu J等在转基因马铃薯中表达了鼠轮状病毒VP6基因(Transgenic Research，2003，12163-169)。但是，在上述研究中，VP6蛋白的表达量都很低，最高含量仅达到马铃薯块茎总可溶性蛋白的0.1％。因为低水平表达的抗原直接口服可能引起机体的免疫耐受，所以增加转基因植株中抗原基因的表达量已经成为发展可食用疫苗的关键因素。迄今为止，已有多种双子叶植物和单子叶植物用于生产疫苗，目前已报道的表达抗原蛋白的植物材料主要集中在烟草和马铃薯，这主要是因为这两种植物的遗传转化易于操作，但是烟草中含有尼古丁等对人体有害的成分，而马铃薯又不宜生食，煮熟后会导致抗原蛋白含量降低50％，所以这两种植物不适于商品化生产口服疫苗。对于轮状病毒感染引起的人和动物的腹泻目前尚无有效的治疗和预防手段，本领域迫切需要开发研制一种安全高效的疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供在双子叶植物中，特别是在苜蓿中具有较高表达量的轮状病毒VP6蛋白的一种编码基因。本专利技术所提供的轮状病毒VP6蛋白编码基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且在双子叶植物中具有较高表达量的DNA序列。所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。序列表中的序列1由1194个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第1位至1194位碱基，编码397个氨基酸残基的VP6，名称为sVP6基因，其单链DNA的分子量为367.86，双链DNA的分子量为736.0。序列表中的序列2由1216个碱基组成，自序列2的5′端第1-8位碱基是Kozak序列(AACCATGG)，自序列2的5′端第5-1195位碱基是sVP6编码序列，自序列2的5′端第1196-1213位碱基是一个内质网固位信号肽SEKDEL序列(TCT GAG AAA GAT GAG CTA)，自序列2本文档来自技高网...

【技术保护点】
轮状病毒ＶＰ６蛋白编码基因，具有下述核苷酸序列之一：１）序列表中ＳＥＱＩＤ№：１的ＤＮＡ序列；２）序列表中ＳＥＱＩＤ№：２的ＤＮＡ序列；３）在高严谨条件下可与序列表中ＳＥＱＩＤ№：１或ＳＥＱ　 　ＩＤ№：２限定的ＤＮＡ序列杂交的核苷酸序列；４）与序列表中ＳＥＱＩＤ№：１或ＳＥＱＩＤ№：２限定的ＤＮＡ序列具有８０％以上同源性，且在双子叶植物中具有较高表达量的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，董江丽，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]