本发明专利技术涉及一种棕点湍蛙抗菌肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。该抗菌肽是从中国两栖类动物棕点湍蛙基因编码的一种单链多肽，分子量２６６６．４道尔顿，等电点９．７０，多肽全序列一级结构为：Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｍｅｔ ＬｅｕＡｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｃｙｓ－ＡＭＩＤＡＴＩＯＮ。编码棕点湍蛙抗菌肽的基因由４４２个核苷酸组成，其中编码成熟棕点湍蛙抗菌肽为第２４７－３１８位核苷酸。人工合成的棕点湍蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种棕点湍蛙(Amolops loloensis)抗菌肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。
技术介绍
自从抗生素专利技术以来，人类在控制和治疗微生物感染疾病中取得了较大的成就。但随着“传统抗生素”的持续使用，不断产生出诸多新问题。目前，微生物抗药性已成为临床微生物感染疾病治疗的重大问题，以至于某些病原细菌已没有临床治疗的一线药物。万古霉素抗性的葡萄球菌、肠球菌以及其他革兰氏阴性感染疾病目前均是世界范围内的临床难题，三类主要引起脑膜炎的细菌在临床上也出现了强的抗药性，抗青霉素、氯霉素脑膜炎双球菌、肺炎球菌，对抗新头孢菌素抗生素的肺炎球菌也广泛出现。因此新一类抗生素的研制已成为当务之急和国际上的热点。研究发现，多肽抗生素具有广谱的抗菌活性，同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性如在最小作用浓度时，快速而广谱地杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)；对真菌也有抑制作用；不会诱导抗药菌株的产生；对于局部感染和全身感染都有效，有希望成为新一代抗菌剂，其研制目前受到广泛重视。很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctislimnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药专利技术的热点。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的抗菌肽，而且有些已进入临床治疗。如从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床；Intrabiotics公司生产的抗菌肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验；Applied Microbiology公司与Astra公司合作用抗菌肽nisin治疗胃溃疡的临床试验也取得良好的疗效。我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。棕点湍蛙(Amolops loloensis)主要分布于四川、云南省，是我国特色资源动物之一。专利技术人将本专利技术的棕点湍蛙抗菌肽全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。专利技术人将本专利技术的棕点湍蛙抗菌肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的具有广谱抗微生物(包括革兰氏阴、阳性细菌，真菌)的棕点湍蛙抗菌肽及其基因和在制药中的应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供如下技术方案棕点湍蛙抗菌肽棕点湍蛙抗菌肽是中国两栖类棕点湍蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量2666.4道尔顿，等电点9.70，多肽全序列一级结构为Phe Leu Pro Met LeuAla Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。棕点湍蛙抗菌肽基因的克隆包括棕点湍蛙皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选棕点湍蛙抗菌肽基因。扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5’ATAAGACATCTGATGTGCATTTAGC 3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的5’PCR Primer引物，其序列为5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码棕点湍蛙抗菌肽的基因由442个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为taagcagtgg tatcaacgca gagtggccat tacggccggg ggagacctcc actgaagtct 60tccagctctc tacattctca gcaccaactg aaccacccga gcccaaagat gttcaccttg120aagaaatcca tgttactcct tttcttcctt gggaccatca acttatctct ctgtgagcaa180gagagaaatg cagatgagga agaaagaaga gatgatgatg aaatggatgt tgaagtggaa240aaacgatttt taccaatgtt ggccggtctg gctgctaatt tcttgccaaa attattttgt300aaaataacca aaaaatgttg aaactctgga attggaaatc atctgatgtg gaatatcatt360tagctaaatg cacatcagat gtcttataaa aaaataaaga tatctcaaac atcaaaaaaa420aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa442编码棕点湍蛙成熟抗菌肽为第247-318位核苷酸，其氨基酸序列为Phe Leu Pro Met Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Leu Phe1 5 10 15Cys Lys Ile Thr Lys Lys Cys-AMIDATION。20棕点湍蛙抗菌肽基因作为基因工程制备棕点湍蛙抗菌肽的应用。棕点湍蛙抗菌肽的制备方法根据编码棕点湍蛙抗菌肽的基因推断棕点湍蛙抗菌肽的氨基酸序列，用自动多联合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardmentmass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。棕点湍蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。本专利技术的有益效果在于由棕点湍蛙抗菌肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的棕点湍蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用。该棕点湍蛙抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。具体实施例方式实施例一棕点湍蛙抗菌肽基因克隆I，棕点湍蛙皮肤总RNA提取A.活体棕点湍蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟B.加入等体积酚/氯仿溶液，，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉本文档来自技高网...
【技术保护点】
棕点湍蛙抗菌肽，其特征在于：棕点湍蛙抗菌肽是中国两栖类棕点湍蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量２６６６．４道尔顿，等电点９．７０，多肽全序列为：ＰｈｅＬｅｕＰｒｏＭｅｔＬｅｕＡｌａＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｌａＡｓｎＰｈｅＬｅｕＰｒｏＬｙｓＬｅｕＰｈｅＣｙｓＬｙｓＩｌｅＴｈｒＬｙｓＬｙｓＣｙｓ－ＡＭＩＤＡＴＩＯＮ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赖仞，徐学清，梁建国，韩曜平，杨海龙，李建许，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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