一种修复溃疡的生物制剂制造技术

本发明专利技术公开了一种修复溃疡的生物制剂，属于基因工程制药技术领域。即将从人胎盘ｃＤＮＡ文库得到的人肝细胞生长因子基因克隆至自行构建的真核表达载体ｐｃＫ上，获得人肝细胞生长因子基因的真核表达载体ｐｃＫＨ，并将其转入减毒沙门氏菌Ｔｙ－２１ａ菌株，构成携带人肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌工程菌株，将减毒沙门氏菌工程菌株经过大规模发酵后，收集菌体冻干后，与分散剂和辅料制成分散片或胶囊或喷涂剂等内外用制剂。发明专利技术的特点是将人肝细胞生长因子可快速修复溃疡的功能及减毒沙门氏菌作为细胞载体和提高机体免疫的功能相结合，作为制备治疗修复胃溃疡、十二指肠溃疡、口腔溃疡、皮肤溃疡或其它溃疡药物的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程制药
，具体地说涉及一种携带人肝细胞生长因子基因真核表达载体、将该载体转入减毒沙门氏菌形成的工程菌株、以及利用该工程菌株生产的工程菌制剂及其应用。
技术介绍
溃疡是一类常见病，包括胃溃疡、十二指肠溃疡、口腔溃疡、烧烫伤或外伤感染或糖尿病性或局部放疗引起的皮肤难愈合性溃疡等，给患者造成巨大痛苦，也给医疗工作带来巨大负担。胃溃疡流行病学调查表明，人口中约有10％在其一生中患过本病，而且随着社会的不断进步，各种压力增加，生活习惯、神经精神因素等导致的胃溃疡的发病率越来越高，胃溃疡由于病情延绵，病情复杂，病情加重或治疗不及时，还会导致出血、穿孔、幽门梗阻和癌变等后果，严重危害人民健康，所以应予以高度的重视。口腔溃疡是口腔粘膜疾病中最常见的溃疡性损害，可单发或多发于口腔粘膜的任何部位，临床以口腔溃疡反复发作，伴有剧烈自发性灼痛为特点，发病年龄以青壮年为多，而且女性多发于男性。口腔溃疡临床多见于患者唇内侧、舌头、舌腹、颊粘膜、前庭沟及软腭等部位，由于这些地方的粘膜缺乏角化层或角化较差，缺乏对刺激的防护功能，所以咀嚼食物和刷牙等都可以引起创伤而导致溃疡。大多数患者在没有得到有效治疗的情况下，口腔溃疡发病多年以后病情呈逐渐加重趋势，表现为口腔溃疡的发作越来越频繁，溃疡面越来越多，溃疡发作的时间延长，甚至发展到持续不愈的状况。皮肤溃疡是真皮或真皮以下的限局性皮肤缺损，其表面常覆盖有脓液、坏死组织或痂皮，愈后遗有瘢痕，可由感染、外伤、结节、肿瘤的破溃或糖尿病等所致，其大小、形态、深浅、发展过程等也不一致。目前还没有非常有效的方法来促进这些溃疡的快速愈合。人肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)最初作为一种肝细胞有丝分裂原是从肝部分切除大鼠的血清中分离得到的(Nakamura T，et al.Biochem Biophys Res Commun，1984；1221450)。随后相继从大鼠血小板、人血浆、人血清、大鼠肝等中分离纯化，分子量为87-105kD(Nakamura T，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1986；836489；Gohda E，et al.J Clin Invest，1988；81414；Zarnegar R，et al.Cancer Res，1989；493314；Asami O，et al.J Biochem；1991；1098)。其前体是由728个氨基酸残基组成的单链，经蛋白酶水解作用产生具有生物活性的异二聚体，成熟的HGF蛋白分子由分子量为55-65kD的重链(α链)和分子量为32-36kD的轻链(β链)通过二硫键相连接。其中重链结构中包含4个Krigle结构，Krigle结构是由三个二硫键连成的双环状多肽结构。HGF中的Krigle结构与纤溶酶原具有38％的同源性，但其与HGF功能的关系目前不是十分清楚。HGF的轻链结构与丝氨酸蛋白酶结构相似，然而其与HGF功能的关系还不太了解，但其轻链蛋白序列与HGF的细胞运动作用有关(Nakamura T，et al.Nature，1989；342440；Mizuno K，et al.Biochem Biophy Res Commun，1994；1981161；Miyazawa K，et al.JBiol Chem，1993；26810024)。HGF主要由间质细胞产生，在鼠、兔、人的各种组织中表达，是体内广泛分布的一种细胞因子。人HGF基因大约70kb，含有8个外显子和17个内含子，HGF基因定位于第7号染色体上(7q21.1)，人和鼠HGF cDNA序列高度保守(＞90％)，其生物学活性无明显种属差异(Nakamura T，et al.Nature，1989；342440)。HGF是一多功能生长因子，通过与其特异性膜受体c-met结合而发挥其多样生物学作用，是间质和上皮/内皮细胞间相互作用的重要信息分子，对胚胎发育、组织器官再生、伤口愈合和血管发生起重要的调节作用(Sonnenberg E，et al.J Cell Biol，1993；123223；Jennische E，et al.Am J Physiol.1993；265C122；Igawa T，et al.Am J Physiol，1993；265F61；Boccacci C，et al.Nature，1998；391285；GiordanosS，et al.Nature，1989；339155；Bottaro DP，et al.Science，1991；251802；Naldini L，et al.Oncogene，1991；6501)。HGF及其受体分布于多种器官及组织(Wolff H，et al.Hepatol，1991；14488)，其广泛分布表明，HGF对多种组织器官有营养作用。HGF最初被认为是一种肝细胞有丝分裂原，后来发现其对多种组织细胞的分裂、扩散和形态发生起重要的调节作用。尤其在肝脏的发育和再生中，HGF起着至关重要的作用，HGF可治疗重症肝炎、急性肝炎，防治肝纤维化、肝硬化和肝癌。HGF对肾脏疾患也有非常重要的治疗作用，可防治肾纤维化、急慢性肾功能不全等。研究表明在生理状况下HGF可促进肺上皮细胞的发生、支气管系统的管腔形成及肺支气管上皮细胞的增生，从而为HGF治疗肺纤维化、肺炎等疾患奠定了基础。HGF以其促进血管内皮细胞增生的作用使其极有可能用于临床治疗血管外伤和外周血管病、防止冠状动脉血管术后狭窄、防治动脉硬化，并可以其抗纤维化作用而用于治疗心肌炎和心肌梗死。HGF还可促进神经的发生、生存和再生，对神经有营养作用，可用于预防和治疗神经损伤。由此可见，HGF是一生物活性极为广泛的细胞因子，HGF将以其多种药理作用渗透于临床治疗的各个领域(刘克辛.《肝细胞增殖因子(HGF)分子医学研究最新进展》，天津科学技术出版社.2001，1-140)。HGF在理论上可从多方面促进溃疡的有效、高质量愈合。首先，HGF可刺激血管内皮细胞的迁移、增殖，形成新生血管(Bussolino F，et al.J Cell Biol，1992；119629；Morimoto A，etal.Biochem Biophys Res Commun，1991；1791042；Sato Y，et al.Exp Cell Res，1993；204223)，促进局部血液循环从而加速溃疡愈合；有报道HGF可浓度依存性地促进原代培养家兔胃黏膜上皮细胞的增殖，明显加速家兔胃黏膜上皮细胞损伤的修复(Watanabe S，et al.Biochem Biophys ResCommun 1994，1991453)。除了动物体外实验模型外，Takahashi等还建立了人胃黏膜上皮细胞溃疡模型，发现前列腺素E1的抗溃疡作用是通过促进胃的成纤维细胞释放HGF来发挥的(Takahashi M，et al.J Clin Invest 1996；982604)。Hori K等检测了20名胃溃疡病人溃疡病灶中HGF mRNA的水平，发现HGF mRNA明显升高(Hori et al.Scand J Gastroenterol 2000，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体ｐｃＫＨ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：哈小琴，樊俊杰，吴祖泽，吕同德，贺冠宪，赵治华，尹强，牛廷献，李富军，唐瑜，王晓辉，
申请(专利权)人：中国人民解放军兰州军区兰州总医院，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]