本发明专利技术公开了一种抗胃泌素释放肽核酸疫苗及制备方法。该核酸疫苗含有编码ＳＥＱ ＩＤＮＯ．１所示的氨基酸序列的核苷酸序列。该核酸疫苗免疫机体后能诱发机体产生特异性的抗胃泌素释放肽抗体。在医学领域中，该核酸疫苗可用于预防和治疗前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤。
【技术实现步骤摘要】
技术领城在医学领域中本专利技术公开了一种治疗和预防前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤的核酸疫苗。
技术介绍
蛙皮素(bombesin，BN)是一种含14个氨基酸残基的生物活性多肽，它最初于1971年由Anastasi和Erspamer从欧洲铃蟾皮肤中提取出来。之后在哺乳动物中发现了与之对应具有相似功能的肽，包括胃泌素释放肽(GRP，gastrin-releasing peptide)、神经介素B(NMB，neuromedin B)、神经介素C(NMC，neuromedin C)。这些肽在C端部分都是非常保守的，而其C端部分正是其发挥生物活性的重要部位。胃泌素释放肽及其样肽的氨基酸序列如下Bombesin(14aa)Glp-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2h-GRP(27aa)R-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2h-NMB(32aa)R-His-Ser-Arg-Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2h-NMC(10aa)Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2R＝Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-MetR’＝Ala-Pro-Leu-Ser-Trp-Asp-Leu-Pro-Glu-Pro-Arg-Ser-Arg-Ala-Ser-Lys-Ile-Arg-Val胃泌素释放肽及其样肽具有广泛的生物学功能。他们作用于心血管中枢而影响心率和血压，参与体温调节，参与平滑肌的收缩，促进胃泌素、胆囊收缩素、胰高血糖素等的释放，抑制动物的摄食行为，改善学习和记忆等。胃泌素释放肽及其样肽作为自分泌或旁分泌生长因子能促进肿瘤细胞的增殖。胃泌素释放肽及其样肽通过与肿瘤中的相应受体结合，引发一系列信号传导途径及基因调控，从而促进肿瘤细胞的增殖。胃泌素释放肽受体家族为G蛋白偶联受体，在哺乳动物中目前已发现3种不同的受体，包括GRP受体(配体主要为GRP)、NMB受体(配体主要为NMB)和BRS3受体(配体尚不清楚)。大量的研究证实在各种肿瘤(结肠癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等)中均有胃泌素释放肽受体家族的异常表达，且其中以GRP受体为主。有研究发现在20例人小细胞肺癌样本中发现有19例表达胃泌素释放肽受体家族；在13例人非小细胞肺癌样本中有12例表达胃泌素释放肽受体家族。胃泌素释放肽及其样肽对肿瘤发生的作用不仅仅是刺激肿瘤细胞增殖，还能影响到肿瘤的分化、血管生成、细胞粘附和细胞转移。由于胃泌素释放肽及其样肽与肿瘤的生长与分化有很大的关系，故有望成为抗肿瘤药的一个有希望的靶点。现已证实胃泌素释放肽及其样肽的受体拮抗剂以及单克隆抗体可较为有效地抑制前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤的肿瘤的生长。目前已经开发和筛选出了很多胃泌素释放肽受体家族拮抗剂，如PD168368是非肽类NMB受体拮抗剂，与NMB受体有很强的亲和力。C6神经胶质瘤细胞表达NMB受体，PD168368能显著抑制C6细胞在体内和体外的增殖。RC-3095是一种较为常见的胃泌素释放肽受体家族拮抗剂，与GRP受体有较高亲和力，在体内可以抑制血管生成，并能下调HER-2受体。在各种裸鼠移植肿瘤模型中，该物质均表现出不同程度的抗肿瘤作用。针对胃泌素释放肽及其样肽本身的抗体治疗则成为肿瘤治疗的另外一条途径。2A11是一种鼠蛙皮素单克隆抗体，与GRP有很强的亲和力。小细胞肺癌(SCLC)细胞会表达和分泌胃泌素释放肽，2A11在体外可以抑制SCLC细胞的增殖，在体内可以抑制鼠SCLC细胞移植瘤的生长。2A11可以有效地拮抗胃泌素释放肽的作用，从而抑制头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)细胞在体外和体内的增殖。针对胃泌素释放肽及其样肽表位开发核酸疫苗也可能会成为一条肿瘤治疗的新途径，这样不但可以完全阻断胃泌素释放肽及其样肽刺激肿瘤细胞增殖的作用，还避免了反复多次给药的麻烦。胃泌素释放肽的C端7至8个氨基酸已被证实为其抗原表位，这为核酸疫苗的开发提供了基础。核酸疫苗是指将含有编码抗原蛋白目的基因的质较载体直接注入体内，通过宿主细胞的转录翻译系统表达目的抗原，并诱导机体产生免疫应答的一种新型疫苗。由于其在体内选择性表达目的产物，并将其以自然加工形式递呈给免疫识别系统，故兼具重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的双重性。与传统的疫苗相比具有免疫原性好，效果持久等特点。本专利技术是基于上述考虑而进行，获得了一种以SEQ ID NO.1序列为靶抗原表位的抗胃泌素释放肽核酸疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗胃泌素释放肽核酸疫苗。本专利技术的另一目的是提供一种生产该核酸疫苗的方法。本专利技术还有一个目的是公开该核酸疫苗的用途。在本专利技术的第一个方面提供了一种以SEQ ID NO.1序列为靶抗原表位的抗胃泌素释放肽核酸疫苗。作为本专利技术的一个具体方式，本专利技术的抗胃泌素释放肽核酸疫苗pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2除含有真核表达载体基本元件外，在其编码区5’端至3’端依次含有编码人VEGF信号肽的核苷酸序列、编码分枝杆菌的热休克蛋白65(HSP65)的核苷酸序列、编码破伤风毒素T辅助细胞表位(TT830-844)的核苷酸序列、编码恶性疟原虫环子孢子抗原T辅助细胞表位(PADRE)的核苷酸序列、编码六拷贝的GRP18-27(SEQ ID NO.2)的核苷酸序列和编码两段分枝杆菌来源的热休克蛋白70第407位至第426位氨基酸(mHSP407-426)的核苷酸序列。所述的VEGF信号肽的氨基酸序列是MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAA，TT830-844的氨基酸序列是QYIKANSKFIGITEL，PADRE的氨基酸序列是AKFVAAWTLKAAA，mHSP407-426的氨基酸序列是QPSVQIQVYQGEREIAAHNK。该核酸疫苗pCR3.1-CpG8-VS-HSP65-TP-GRP6-M2的结构框架图见说明书附图1，测序图见附图2。GRP为自身抗原，分子量小，免疫原性弱，直接用GRP21-27(SEQ ID NO.1)基因作免疫原在体内表达很难在体内激发免疫反应，产生相应的抗体。为增强抗胃泌素释放肽核酸疫苗的免疫原性，必须采用大分子蛋白作为免疫载体。HSP65是指源于用作卡介苗的分枝杆菌来源的热激蛋白，国际基因库登录号是M17705。HSP65已被证实具有活化巨噬细胞和释放诸多细胞因子的功能，是一种良好的免疫佐剂。带有信号肽的抗原既能主动分泌，又能保持良好的构象，与有相应受体的细胞结合。研究表明在真核细胞中分泌表达的融合热休克蛋白能显著增强融合抗原的特异性免疫反应。因此本专利技术采用能在真核细胞分泌的HSP65作为免疫载体。为进一步增强抗胃泌素释放肽核酸疫苗的免疫原性，我们将编码GRP18-27(SEQ ID NO.2)的核苷酸序列重复六次。另外，在抗胃泌素释放肽核酸疫苗中还引入本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗胃泌素释放肽核酸疫苗，其特征在于真核表达载体中含有编码ＳＥＱＩＤＮＯ．１所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘景晶，欧阳可栋，吴国君，过为，吴洁，曹荣月，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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