检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡及其制备方法和应用。靶向纳米微泡包括脂质双分子外壳和包裹在脂质双分子外壳内部的惰性气体，在脂质双分子外壳上连接有针对小细胞肺癌的抗前胃泌素释放肽单克隆抗体，纳米微泡平均粒径在300‑400nm。制备方法：通过薄膜水化法将二棕榈卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈磷脂酸完全溶解于氯仿中制成脂质体，针对小细胞肺癌的抗前胃泌素释放肽单克隆抗体用巯基乙胺打开，与上述脂质体孵育，形成稳定的硫醚键，然后通入全氟丙烷气体,通过机械震荡的方法获得靶向小细胞肺癌的含有抗前胃泌素释放肽单克隆抗体靶向纳米微泡。该靶向纳米微泡可应用于彩色多普勒超声检测小细胞肺癌。

【技术实现步骤摘要】
检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种靶向纳米微泡，具体是一种检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡的制备方法和应用。
技术介绍
小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)约占肺癌20％，两年生存率不到5％，在肺癌中恶性度最高，发病原因不明，是一种可产生多种异位激素的神经内分泌肿瘤常规检查X线、CT及MRI对SCLC的诊断缺乏特异性，常在确诊时已到了SCLC的晚期(KalemkerianGP,eta1.Smallcelllungcancer.JNatlComprCancNetw2013，11(1)：78-98.)。1981年，McDonald等发现SCLC细胞株能够分泌胃泌素释放肽(GRP)并含有GRP受体(McDonaldTJ,eta1.Aqualitativecomparisonofcanineplasmagastroenteropancreatichormoneresponsetobombesinandtheporcinegastrin-releasingpeptide(GRP).RegulPept，1981，2(5)：293-304.)，但其在血液中的半衰期仅两分钟，前胃泌素释放肽(proGRP)与GRP等摩尔分泌，在血液中相对稳定(MiyakeY,eta1.Progastrin-releasingpeptide(31-98)isaspecifictumormarkerinpatientswithsmallcelllungcarcinoma[J].CancerRes，1994，54(8)：2136-2140.)。我们与中国辐射研究院合作,用ProGRP(31-98)作为抗原免疫Balb/c小鼠成功制备并筛选出抗-ProGRP单克隆抗体，并研究了其的纯化及体外对SCLC的活性(崔大伟,王伟,周小林,等人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备.中国生物制品学杂志，2007，20(3)：166-169；周小林等.抗前胃泌素释放肽单克隆抗体的纯化及体外对小细胞肺癌的活性。肿瘤研究与临床2011,7(23):467-470.)。随着分子生物学技术的发展与延伸，超声造影不再局限于仅仅获取组织的血流灌注信息，而是逐渐应用于特异性的超声分子成像。高特异性靶向超声微泡的设计和构建是实现超声分子显像的基础和重要环节。靶向超声微泡是将特异性抗体或配体与微泡表面连接，静脉注射后，使其能够较长时间定向地聚积于靶组织或器官，使靶区超声图像特异性增强或进行靶向治疗(WangD,etal.Combinationofhigh-intensityfocusedultrasoundwithnanoscaleultrasoundcontrastagentintreatmentofrabbitbreastVX2tumors:apilotstudy.ClinImaging.2012.36(6):717-723.)。超声微泡是一种气-液乳剂，目前用的微泡是微米级的,由脂质外壳包裹惰性气体六氟化硫构成，粒径1～8μm属于血池显影，它只能停留在血管腔内，这就限制了在细胞及分子水平上探查疾病的发生、发展及转化过程(DeshpandeN,etal.Molecularultrasoundimaging:currentstatusandfuturedirections.ClinRadiol.2010.65(7):567-581.)；而肿瘤血管内皮间隙扩大，最大孔径可达780nm(MaedaH,etal.Vascularpermeabilityincancerandinfectionasrelatedtomacromoleculardrugdelivery,withemphasisontheEPReffectfortumor-selectivedrugtargeting.ProcJpnAcadSerBPhysBiolSci.2012.88(3):53-71.)，因此纳米微泡(粒径小于700nm)可以穿透血管内皮实现血管外靶组织显像，反应真正的发病机制，大幅度提高影像诊断的灵敏性和准确性。因而研制针对肿瘤细胞自身表达的特异性抗原的靶向纳米超声微泡，实现肿瘤细胞特异性的分子成像，具有重要的意义。目前国内外尚未见有关抗ProGRP单克隆抗体靶向的纳米微泡的构建、靶向分子显影的超声检测的研究。针对目前SCLC诊断中的问题和难点，我们构建了一种以抗-ProGRP单克隆抗体为靶向的纳米超声微泡，能穿过SCLC肿瘤血管，与SCLC细胞特异性靶向结合，为SCLC的靶向分子显影提供新的方法和研究基础，将有利于SCLC的早期诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能特异性靶向检测小细胞肺癌的纳米级超声微泡，并提供一种构建靶向检测小细胞肺癌的纳米级超声微泡的方法，以及该纳米微泡在医学诊断中的应用。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案是：一种检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡，包括脂质双分子外壳和包裹在脂质双分子外壳内部的惰性气体，在脂质双分子外壳上连接有针对小细胞肺癌的抗前胃泌素释放肽单克隆抗体，纳米微泡平均粒径在300-400nm；所述的脂质双分子由二棕榈卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈磷脂酸(DPPA)混合制成；所述的惰性气体为全氟丙烷气体(C3F8)。一种检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡的制备方法，包括如下步骤：1)采用薄膜水化法，按质量17-20:2-3:1将二棕榈卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈磷脂酸溶解于氯仿中；在通风橱中待氯仿自然挥发形成磷脂薄膜；在磷脂薄膜中加入体积比PBS：甘油＝9：1的水化液，室温下摇床上水化60min形成脂质体；2)取抗前胃泌素释放肽单克隆抗体用10mMPBS-EDTA(NaCl8g/L,KCl0.2g/L,Na2HPO41.44g/L)稀释；将巯基乙胺溶于PBST中；将上述抗体和巯基乙胺的PBS-EDTAT溶液混合，37℃孵育90min，用每PBS-EDTA溶液超滤3次，超滤条件：3000rpm，8min，4℃，得到单链抗体；3)将单链抗体与脂质体孵育，4℃过夜，次日用PBS溶液超滤洗涤三次，去除没有链接在脂质体上的单链抗体，用PBS溶液重悬，通入全氟丙烷气体(C3F8)、用银汞胶囊调和器机械震荡45s，静置后弃去上层泡沫，所得乳白色悬液即靶向纳米微泡。粒径测量：用Zeta电位及粒径分析仪对纳米微泡粒径进行测量(共测7次)，靶向纳米微泡的粒径小于700nm。其中所述的靶向抗体是针对小细胞肺癌的抗前胃泌素释放肽单克隆抗体，该抗体可与小细胞肺癌细胞株上的胃泌素释放肽受体结合。本专利技术检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡，其中所述的纳米微泡与抗前胃泌素释放肽单克隆抗体的连接是利用微泡表面的马来酰亚胺键和单克隆抗体打开后的巯基反应形成稳定的硫醚键，从而将单克隆抗体片段连接在微泡上，不仅使单克隆抗体的分子量减半，暴露保守的Fc段中的巯基，而且不影响抗体的抗原识别效能。本专利技术检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡，可以通过静脉注射使纳米微泡穿过小细胞肺癌肿瘤血管，进入肿瘤组织间隙，与小细胞肺癌细胞特异性结合，在肿瘤部位有效富集以及停留延长，通过聚集成像清晰区分病变组织和周围的正常组织,应用彩色多普本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡，包括脂质双分子外壳和包裹在脂质双分子外壳内部的惰性气体，特征在于，在脂质双分子外壳上连接有针对小细胞肺癌的抗前胃泌素释放肽单克隆抗体，纳米微泡平均粒径在300‑400nm；所述的脂质双分子由二棕榈卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈磷脂酸混合制成；所述的惰性气体为全氟丙烷气体。

【技术特征摘要】
1.一种检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡，包括脂质双分子外壳和包裹在脂质双分子外壳内部的惰性气体，特征在于，在脂质双分子外壳上连接有针对小细胞肺癌的抗前胃泌素释放肽单克隆抗体，纳米微泡平均粒径在300-400nm；所述的脂质双分子由二棕榈卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈磷脂酸混合制成；所述的惰性气体为全氟丙烷气体；所述的检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡的制备方法，包括如下步骤：1)采用薄膜水化法，按质量17-20:2-3:1将二棕榈卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈磷脂酸溶解于氯仿中；在通风橱中待氯仿自然挥发形成磷脂薄膜；在磷脂薄膜中加入体积比PBS：甘油＝9：1的水化液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟，王金萍，许静，梁爱华，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14