一种识别并筛选具有增强透皮给药能力的多肽的方法，包括体内噬菌体展示技术，其特征在于该方法包括： （ａ）在动物体或人体皮肤的适当区域涂以噬菌体展示多肽库； （ｂ）从所述动物或人的循环系统、器官、组织以及细胞中回收噬菌体颗粒； （ｃ）扩增回收的噬菌体用于下一轮体内筛选； （ｄ）重复上述（ａ）到（ｃ）的步骤至少一次； （ｅ）对回收的噬菌体挑取单克隆，验证其透皮能力后测序，获得所编码的展示多肽。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术主要涉及非扩散的经皮或透皮给药。特别地，本专利技术是关于一种识别并筛选多肽的方法，该多肽能够增强和/或方便任意治疗性制剂和/或药物的透皮，这些治疗性制剂和/或药物包括任何多肽，蛋白质，多聚核苷酸、寡聚核苷酸(反义寡聚核苷酸制剂)、核酶、双链RNA(dsRNAs)、小干扰RNA(siRNAs)、RNA干扰、基因治疗载体、疫苗和任何常规药物。本专利技术还涉及增强这些治疗性制剂和药物的经皮或透皮给药的组合物和方法。
技术介绍
作为人体最大的器官，皮肤提供了一个无痛并且合适的系统性给药的介体(Prausnitz etal.，2004，Nature Rev.Drug Discov.3115；Thomas and Finnin，2004，Drug Discov.Today 9697；and Zaffaroni，1991，Ann.N.Y.Acad.Sci.618405)。然而，外来的分子，特别是大的亲水分子，通过皮肤的穿透力是非常低的，这主要是由于角质层的阻挡。角质层是皮肤外表面由表皮细胞组成的独特的富脂基质分层结构(Scheuplein and Blank，1971，Physiol.Rev.51702)。许多化学渗透增强剂被用来试图打开皮肤屏障，但大多数效果不理想(Williams andBarry，2004，Adv.Drug Deliv.Rev.56603；Purdon et al.，2004，Crit.Rev.Ther. Drug CarrierSyst.2197；Kanikkannan et al.，2000，Curr.Med.Chem.7593；and Finnin and Morgan，1999，J.Pharm.Sci.88955)。如果没有物理方法的帮助，化学透皮增强剂难以有效地将亲水性药物(特别是分子量＞500Da的药物)透过未破坏的皮肤进入到血液循环，并达到治疗所需的血药水平(Bos and Meinardi，2000，Exp.Dermatol.9165)。此外现有的化学透皮增强剂容易导致皮肤损伤、发炎、过敏、系统毒性等，在临床上的使用大大受到限制。常用的物理方法有离子电渗(Kalia et al.，2004，Adv.Drug Deliv.Rev.56619；Hirvonen et al.，1996，Nat.Biotechnol.141710)、超声(Lavon and Kost，2004，Drug Discov.Today 9670；Mitragotri et al.，1995，Science 269850)、微针(McAllister et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10013755；Prausnitz，2004，Adv.Drug Deliv.Rev.56581)等，已证明对多种药物有增进透皮的效果。但物理方法有许多不足，包括需要特别仪器，成本高，剂型灵活性差，不同程度上有疼痛感，不适合家庭使用等。找到一个新奇的透皮增强物能克服这些限制是具有重大意义的，它能改变透皮给药的现状。体内噬菌体展示技术的方法已被用来识别并筛选组织和器官的靶向多肽(Pasqualiniand Ruoslahti，1996，Nature 380364；Arap et al.，1998，Science 279377；Raffii et al.，2003，Cancer Cell 4331；Kolonin et al.，2004，Nature Med.10625)。通常，噬菌体展示技术描述了一种筛选技术，其中有多种(通常＞109)肽或蛋白质表达在噬菌体病毒的外壳上并形成噬菌体文库，噬菌体的遗传物质编码这些多肽或蛋白质的氨基酸残基(Sidhu et al.，2003，Chembiochem.414；Ferrer et al.，1999，J.Pept.Res.54，32；BouHamdan et al.，1998，J.Biol.Chem.2738009)，从而形成了每个不同的蛋白质序列和编码它的DNA的连接关系。通过体内或体外平板上进行的淘选过程(Whaley et al.，2000，Nature，405，665)，可以快速地找到与某种器官、组织或靶分子(如抗体、酶、细胞表面受体蛋白等)有特异性相互作用的肽或蛋白质。在一个最简单的淘选方式中，将包被了靶向物质的平板(或珠)与噬菌体展示多肽文库一起进行孵育，然后洗去没有结合的噬菌体，并洗脱出特异结合的噬菌体。洗脱出的噬菌体进行扩增，并且通过附加结合/扩增循环，富集沉积池以利于序列结合。在3-4轮筛选后，用DNA测序和ELISA来表征单独的克隆。然而体内噬菌体展示的方法还没有用于筛选有透皮能力的多肽。已知许多药物分子(Grama and Bouwstra，2002，J.Controlled Release 83253；Grams etal.，2004，J.Controlled Release 98367)，微球体(Rolland et al，1993，Pharm.Res.101783)和脂质体(Li and Hoffman，1995，Nature Med.1795；Hoffman，1997，J.Drug Targeting 567)可以从毛孔渗入，毛囊逐渐被认为是一个重要的药物透皮通道(Lauer et al.，1995，Pharm.Res.12179；Agarwal et al.，2000，Methods Find.Exp.Clin.Pharmacol.22129)。一类可渗透膜的肽，称为蛋白质转导结构域(PTDs；Joliot and Prochiantz，2004，NatureCell Biol.16189)，有报道能增进蛋白质和多肽药物分子的表皮输运(Rothbard et al.，2000，Nature Med.61253；Schutze-Redelmeier et al.，2004，Vaccine 221985；Lopes et al.，2005，Pharm.Res.22750；Lim et al.，2003，J.Cosmet.Sci.54483)。然而PTDs只能局部性而不是系统性输运药物，并且需要与被输运药物联系在一起(通常是共价相连)才能达到使药物透过膜或表皮的效果。因此，很需要开发出新型的能克服上述诸多不足的透皮增强剂，从而有效增强和/或方便药物穿过皮肤，使得进入体循环的药物量增加或者到达靶器官、组织和细胞的药物量增加。此外，新型透皮增强剂应不会导致皮肤损伤、发炎、过敏、系统毒性等，并能用于大分子量药物如多肽、蛋白质和核苷酸的透皮给药。
技术实现思路
本专利技术提供了一种方法，通过噬菌体展示文库筛选出具有增强透皮给药能力的多肽。本专利技术的方法包括如下步骤(a)在动物或人皮肤上任意区域涂用一个噬菌体展示多肽库；(b)从上述动物或人的循环系统、器官、组织以及细胞中回收噬菌体颗粒；(c)扩增回收的噬菌体用于体内筛选，进行至少两个循环；和(d)随机挑选噬菌体平板、测序，以识别插入的编码表达多肽的核苷酸序列。在一个较佳的实施例中，应用本专利技术的方法识别出的多肽具有编码一个展示多肽CSSSPSKHC(TD-2，SEQ ID NO1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1、一种识别并筛选具有增强透皮给药能力的多肽的方法，包括体内噬菌体展示技术，
其特征在于该方法包括：
(a)在动物体或人体皮肤的适当区域涂以噬菌体展示多肽库；
(b)从所述动物或人的循环系统、器官、组织以及细胞中回收噬菌体颗粒；
(c)扩增回收的噬菌体用于下一轮体内筛选；
(d)重复上述(a)到(c)的步骤至少一次；
(e)对回收的噬菌体挑取单克隆，验证其透皮能力后测序，获得所编码的展示多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：温龙平，陈勇平，沈媛媛，郭欣，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，上海诺美医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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