携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因及应用制造技术

携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因的构建及应用，属于植物基因工程领域。本发明专利技术利用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽ｌｓｔｐ和法呢基焦磷酸合成酶基因ｆｐｓ；构建了融合基因ｌｓｔｐ－ｆｐｓ；并将融合基因转入青蒿中，使转基因青蒿表现出提高青蒿素的能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程领域，具体地说是用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp和法呢基焦磷酸合成酶基因fps；构建lstp-fps融合基因及其在转基因青蒿中的应用。
技术介绍
近年的统计资料表明世界有100多个国家和地区的20多亿人生活在疟疾流行区，每年约有2.7亿人患这种疾病，其中有近300万人死于疟疾。正因为疟疾的危害如此严重，世界卫生组织1957年就开始实施了一项“全球消灭疟疾计划”，但至今成效不显。其原因是从60年代起疟原虫对氯喹等主要抗疟药产生抗性，使这些药失去了抗疟药效。为此世界上许多国家都投入了大量人力物力去研究开发新的抗疟药物。青蒿素类药及其衍生物是我国科学工作者发掘祖国医药学宝库研究开发的一类抗疟新药，具有自主知识产权，目前广泛应用于疟疾的治疗。全世界每年青蒿素的需求量为150吨左右，而产量仅为15吨左右，明显供不应求，目前售价已达到约225美元/g。开展青蒿素的研究具有很好的经济效益和社会效益。目前提高我国青蒿产品的科技含量，提升青蒿产业地位已势在必行，这有赖于科技的源头的创新，现代生物技术在生产优质青蒿素药源方面可以起到决定性作用。优质药源的严重匮乏是目前青蒿素生产上面临的最大问题。近几年来，寻找及扩大天然药物青蒿素药源是一个十分活跃的研究领域，取得了很大的进展，主要包括以下三个方面(1)利用传统育种技术培育高含量青蒿素的青蒿栽培品种；(2)青蒿素的化学全合成或半合成；(3)利用现代生物技术提高青蒿中青蒿素含量。在这些研究领域中，培育高含量青蒿素的青蒿栽培品种所需周期太长，效率很低，青蒿素的含量不可能得到大幅度提高，此外，从天然青蒿中提取，产量受资源、环境和季节的限制，且生产成本高、产量低、难以满足市场需求；青蒿素虽已能人工合成，但成本高、难度大，也未能投入生产。相比之下，利用基因工程技术遗传改良青蒿，开展青蒿素代谢工程研究，生产青蒿素就具有很大的优势(1)在生物技术研究领域中，研究人员对青蒿离体培养和青蒿遗传转化的成功，为利用生物技术生产青蒿素奠定了良好的理论和实践基础；(2)利用基因工程技术在基因水平上快速、高效地遗传改良青蒿，获得目标药用成分含量大为提高且具遗传稳定性的转基因药用植物(包括幼苗、毛状根、细胞系等)已经有不少成功报道，实现了我国在植物次生代谢工程研究领域的重大突破。(3)由于目前已阐明了青蒿素生物合成代谢途径中的重要步骤并且相关的限速酶基因已经克隆使得实现青蒿素的代谢工程成为可能。青蒿素属于倍半萜衍生物，青蒿素的生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。植物类异戊二烯的生物合成至少存在两条途径，即甲羟戊酸途径和丙酮酸/磷酸甘油醛途径。此两条途径生成的异戊烯基焦磷酸(IPP)和其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)在牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)的催化下，通过亲电反应机制形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，GPP在法呢基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphate synthase，FPS)催化下形成法呢基焦磷酸(FDP)。FDP进一步转化为青蒿素等萜类物质。FPS对青蒿素的合成具有重要作用，是青蒿素代谢工程的重要靶点。但在转FPS的青蒿毛状根中，青蒿素的含量仅提高了2-3倍，效果不佳。有的研究者提出青蒿素的合成可能在质体中进行，通过提高质体中青蒿素生物合成途径上的关键酶活性有可能提高青蒿素的含量。目前国内外青蒿的相关研究大多集中在青蒿素的分离提取工艺、半合成或全合成、药理作用、组织培养等研究上，而利用转基因技术把青蒿素生物合成的关键酶基因和其他重要相关基因转入青蒿中高效表达、稳定遗传，从而获得青蒿素含量还未见报道。因而，基因工程技术是提供青蒿素优质药源的理想和可持续的途径，有望实现青蒿素的代谢工程，为我国青蒿素产业提供优质的青蒿素药源，有利于以青蒿素产业为契机，拉动我国中药产业升位。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种利用基因工程技术遗传改良青蒿的方法，该方法将携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶基因在青蒿质体中高效表达，从而提高青蒿中青蒿素的合成能力。在本专利技术的另一方面，还提供了一种植物表达载体，它包含上述青蒿携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶基因核苷酸的编码区。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述植物表达载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是青蒿。本专利技术克服了现有技术中的缺点，分别克隆了青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp和法呢基焦磷酸合成酶基因fps，并构建了融合基因。将该融合基因转入植物基因组中，可以提高法呢基焦磷酸合成酶在质体中的活性，从而促进代谢途径向着青蒿素的合成的方向进行，对提高青蒿素的含量有非常重要的意义。本专利技术是通过以下技术方案实现的利用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp和法呢基焦磷酸合成酶基因fps构建lstp-fps融合基因，序列为SEQ ID NO.1。所涉及的青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入SpeI酶切位点，下游引物加入AatII酶切位点上游引物5’-cccactagtatggcatcaattagcttatttcc-3’下游引物5’-cccgacgtctcttgctagaggacttg-3’所设计的青蒿法呢基焦磷酸合成酶基因fps的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入AatII酶切位点，并去掉了fps编码区的起始密码子ATG，下游引物引入BsteII酶切位点上游引物5’-cccgacgtcagtagtaccgatctgaaa-3’下游引物5’-cccggtgacctacttttgcctcttgtaaa-3’Lstp-fps融合基因的构建步骤如下(1)以青蒿总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增lstp，回收产物并进行TA克隆；(2)以青蒿总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增fps，回收产物并进行TA克隆；(3)分别用AatII/Spe I、AatII/Bste II双酶切含有lstp的TA克隆质粒和含有fps基因的TA克隆质粒，回收lstp片段和fps片段；(4)用Spe I/Bste II双酶切pCAMBIA1304质粒，回收大的载体片段；pCAMBIA1304(质粒购买于澳大利亚CAMBIA公司)。(5)混合上述lstp片段、fps片段和pCAMBIA1304载体片段，在T4连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA1304载体上的lstp-fps融合基因的构建。本专利技术还可以利用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽lstp带动青蒿法呢基焦磷酸合成酶基因fps在转基因青蒿细胞的质体中进行表达，用于提高青蒿素的含量。操作过程如下使用融合基因转化青蒿1、将携带lstp-fps融合基因的pCAMBIA1304重组质粒导入农杆菌LBA4404或者EHA105，获得工程菌，命名为LBA4404-lstp-fps或EHA105-lstp-fps，可用于对青蒿的转化。2、根癌农杆菌遗传转化青蒿用YEP液体培养基培养带有lstp-fps融合基因的农杆菌，至OD600为0.3左右离心收集菌体，然后用液体MS培养基重悬菌体；取青蒿无菌苗的叶片，在上述菌液中浸染10min，然后共培养2天；然后转入除菌培养基上除菌培养。随后添加50mg/L潮霉素作为筛选压获得转基因青蒿丛生芽；待丛生芽长到1cm左右时，分别切下单个的本文档来自技高网...

【技术保护点】
携带质体转运肽的法呢基焦磷酸合成酶融合基因，其特征在于，利用青蒿芳樟醇合成酶的转运肽ｌｓｔｐ和法呢基焦磷酸合成酶基因ｆｐｓ，构建融合基因ｌｓｔｐ－ｆｐｓ，基因序列为ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：廖志华，陈敏，谌容，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]