一种用于发光光状杆菌的red/ET重组方法技术

本发明专利技术公开了一种用于发光光状杆菌的ｒｅｄ／ＥＴ重组方法，该重组质粒ｐＡＳＫ－αβγＡ构建如下：以含αβγＡ基因的质粒为模板，以带ＡＳＫ同源臂为引物，通过ＰＣＲ扩增获得带同源臂的ＰＣＲ产物αβγＡ，以ｐＡＳＫ－ＩＢＡ为载体，采用Ｒｅｄ／ＥＴ重组构建质粒ｐＡＳＫ－αβγＡ，对质粒鉴定。该ｒｅｄ／ＥＴ重组如下：首先合成带需修饰基因同源臂的引物；其次ＰＣＲ扩增获得带需修饰基因同源臂打靶基因；第三将ｒｅｄ／ＥＴ重组质粒ｐＡＳＫ－αβγＡ导入ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ中；第四将含有ｐＡＳＫ－αβγＡ的ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ过夜菌接种于ＬＢ中，培养；第五加脱水四环素诱导；第六将带需修饰基因同源臂的打靶基因ＰＣＲ产物转化入ｐＡＳＫ－αβγＡ中；最后是将其铺在选择性ＬＢ平板上，培养，去除质粒ｐＡＳＫ－αβγＡ。该方法同源序列短，重组效率高，快捷方便。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种用于发光光状杆菌的ｒｅｄ／ＥＴ重组方法，它包括下列步骤：Ａ、用于发光光状杆菌的ｒｅｄ／ＥＴ重组质粒ｐＡＳＫ－αβγＡ构建：ａ、带ＡＳＫ同源臂的ＰＣＲ产物αβγＡ的获得，以ｐＳＣ１０１－ＢＡＤ－αβγＡ质粒ＤＮＡ为模板，以 ｐ１、ｐ２为引物，进行ＰＣＲ扩增获得带ＡＳＫ同源臂的ＰＣＲ产物αβγＡ；ｐ１：５’ＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣ ＡＴＧＧＡＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧ’３；Ｐ２：ＡＡＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＡＧＣＴ ＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＧＴＴＡＧＴＴＴＣＴＧＣ；ｂ、重组质粒ｐＡＳＫ－αβγＡ的构建，将３０μｌ过夜菌Ｅ．ｃｏｌｉＹＺ２００５接种于１．４ｍｌＬＢ，振摇２ｈ，采用电转的方法将带ＡＳＫ同源臂的ＰＣＲ产物 αβγＡ和被ＮｃｏＩ酶切ｐＡＳＫ－ＩＢＡ共转化入Ｅ．ｃｏｌｉＹＺ２００５中，恢复培养１ｈ；将其铺在含有１００μｇ／ｍｌ氨苄青霉素的ＬＢ平板上，３７℃过夜培养，从过夜培养的含有１００μｇ／ｍｌ氨苄青霉素的ＬＢ平板挑单克隆，将重组克隆接种于 １．８ｍｌ含有１００μｇ／ｍｌ氨苄青霉素的ＬＢ中，振摇过夜，制备质粒ＤＮＡ，溶于２０μｌｄｄＨ↓［２］Ｏ，取４μｌ质粒ＤＮＡ进行限制性酶切鉴定；挑出克隆制备质粒ＤＮＡ进行测序；Ｂ、利用ｒｅｄ／ＥＴ重组方法在ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　 　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓＤＳＭ１５１３８中将ｃｍ↑［ｒ］基因替换染色体ＤＮＡ上的ｃｉｐＢ基因：ａ、带ｃｉｐＢ同源臂ｃｍ↑［ｒ］基因的引物的合成Ｐ３：５’ＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡ ＴＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＣ３’；ｐ４：５’ＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＧＡＴＴＡＡＡＡＴＴＴＧ ＧＡＧＴＴＴＡＴＧＴＴＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣ３’；ｂ、带ｃｉｐＢ同源臂ｃｍ↑［ｒ］基因ＰＣＲ产物的获得...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐志如，印遇龙，张友明，黄瑞林，
申请(专利权)人：中国科学院亚热带农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]