本发明专利技术公开了一种预防幽门螺杆菌感染的药物制剂以及本发明专利技术作为预防幽门螺杆菌感染的药物的应用。本发明专利技术的所述的药物可以通过鼻腔的方式或其他免疫学可行的给药途径对机体进行免疫，本发明专利技术的制备方法是将三种抗原蛋白与ＣｐＧ－ＯＤＮ在４℃下加入无菌双蒸水溶解、混合，即可制成本发明专利技术所述的药物制剂。采用本发明专利技术对病人进行治疗时，将液体制剂通过鼻道滴入，进入鼻腔，可被鼻粘膜迅速吸收，激发机体的免疫反应而产生保护作用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及免疫领域，尤其涉及预防和治疗幽门螺杆菌感染的药物，具体来说是一种预防幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的药物制剂。
技术介绍
幽门螺杆菌是定居于人胃内的一种革兰氏阴性螺旋状杆菌，自1982年Warren和Marshall发现Hp以来，大量研究表明，Hp感染是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃恶性肿瘤的发生密切相关，并于1996年被世界卫生组织确认为一级致癌原。根除Hp对上述疾病的预防及治疗至关重要，目前的主要方法是药物根除(抗生素加质子泵抑制剂或铋剂)，但是副作用大、复发率高特别是耐药菌株的出现使得药物疗效大受影响，另外，由于人群中Hp自然感染率较高，在我国达50％以上，而Hp具有口-口、粪-口等多种传播途径，难以人为切断。因此，应用常规药物很难在人群中大规模防治Hp。近年来许多学者提出了免疫防治Hp的策略，并取得了积极的进展。研究表明，口服Hp成份抗原及佐剂能够激发有效的免疫保护反应，具有应用于临床治疗及预防Hp感染的前景。目前已发现了多种Hp成份抗原与不同佐剂的有效组合。通过基因工程技术可获得大量有效、无毒的抗原，而通过动物实验证实有效的佐剂仅有霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)，但是二者的毒性作用制约其进一步应用于人体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种预防幽门螺杆菌感染的药物制剂，所述的药物制剂包括尿素酶B亚单位、空泡毒素、外膜蛋白OMP27和药用佐剂，进一步的，所述的佐剂采用一种新型粘膜佐剂CpG-寡核苷酸，所述的CpG-寡核苷酸具有如下的序列5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’。本专利技术的目的还在于提供所述的预防幽门螺杆菌感染的药物制剂在预防和治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。本专利技术的所述的药物可以通过鼻腔的方式或其他免疫学可行的给药途径对机体进行免疫。本专利技术的制备方法是将三种抗原蛋白与CpG-ODN在4℃下加入无菌双蒸水溶解、混合，即可制成本专利技术所述的药物制剂。采用本专利技术对病人进行治疗时，将液体制剂通过鼻道滴入，进入鼻腔，可被鼻粘膜迅速吸收，激发机体的免疫反应而产生保护作用。本专利技术所述的药物也可以通过皮内给药的方式对机体进行免疫。本专利技术和已有技术相对照由于本专利技术由三种纯化的抗原蛋白质与CpG-ODN组成，安全、无毒，而且不会与机体发生交叉反应。尤其是佐剂CpG-ODN的使用，既具有较强的免疫刺激作用，又无其它佐剂的毒性作用，而且本专利技术方法工艺简单，操作方便，易在实验室中完成，也适宜于工厂化生产。附图说明图1为本专利技术所述的药物分别采用粘膜佐剂CpG-寡核苷酸和其它佐剂治疗用于治疗感染动物后，血清中IgG2a水平的比较图。具体实施例方式实施例1H.pylori基因组DNA的抽提H.pylori菌株NCTC11637(由澳大利亚悉尼新南威尔士大学微生物与免疫学学院Andren Lee教授惠赠)生长于琼脂平板上，37℃微需氧条件下培养48小时，收集细菌于PH8.0的TE缓冲液中，分别用溶菌酶、10％SDS及20mg/ml的蛋白酶K作用后，采用酚氯仿抽提法提取Hp全基因组DNA，-20℃下备用。实施例2尿素酶B亚单位(UreaB)基因的制备尿素酶B亚单位(UreaB)基因从EMBL sequence No.M60398中得到该基因全序列。利用GCG基因分析软件系统，对目的基因进行的酶切位点、阅读框、mRNA二级结构分析，引物设计如下sense5’-AGGAAGATGCACGAAGACTGGGGCACC-3’；antisense5’-GAAGATCTGGACGAAAATGCTAAATAGTTG-3’。PCR反应条件94℃热变性4min，94℃ 30sec、45℃ 30sec和72℃ 1.5min 30个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1％Agarose电泳鉴定后，进行割胶回收。实施例3外膜蛋白(OMP27)基因的制备以分离纯化的H.pylori基因组DNA作模板。核酸序列设计引物如下sense 5’-AAAAAAGGTACCGAAGAGAGCGCGGCTTTTGTGGGA-3’；antisense5’-AAAAAAAAGCTTTCATTAAAAATCCCTCAAGTAACTGAT-3’。PCR反应条件94℃热变性3min，94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃°1min，共30个循环，72℃延伸5min。PCR产物用1％Agarose电泳鉴定后，进行割胶回收。实施例4空泡毒素VacA基因的制备从Genebank获得H.pylori NCTC11637 vacA的全基因序列，基因登录号为AF049653。vacA基因全长4544bp，编码约140kDa的VacA前毒素蛋白，本实验克隆其中编码成熟VacA毒素的DNA片段(389bp-2942bp)，表达约95kDa毒素蛋白。利用DNAStar和GeneRunner基因分析软件对目的基因进行阅读框、酶切位点、mRNA二级结构分析，针对此序列设计引物如下sense 5’-CAAAGTCCCATGGCCTTTTTCACAAC-3’，antisense 5’-TTCAAACTGCAGCTCAATAGTGCC-3’；克隆位点为Nco I和Pst I。PCR反应条件为94℃热变性4min，94℃ 30sec、55℃ 1min、72℃ 2.5min共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1％Agarose电泳鉴定后，进行割胶回收。实施例5UreaB基因与载体的酶切与连接用限制性内切酶Sal I酶和BamH I分别对扩增的目的基因片段UreaB和载体质粒pQE-30(购自QIAGEN公司)进行双酶切。酶切反应的反应体系为50μl，其中目的基因或载体质粒的DNA 25μl，10 X Buffer 5μl，两种限制性内切酶各1μl，37℃下消化3小时。酶切产物用1％Agarose凝胶电泳分离鉴定。切胶回收目的基因，与载体质粒分别用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为10μl，含10 X Bufer 1μl，T4连接酶1μl，目的基因和载体DNA按4∶1混匀，16℃连接16小时。实施例6OMP27基因与载体的酶切与连接用限制性内切酶Kpn I和Hind III分别对扩增的目的基因片段OMP27和载体质粒pQE-30进行双酶切。酶切反应的反应体系为50μl，其中目的基因或载体质粒的DNA 25μl，10 X Buffer 5μl，两种限制性内切酶各1μl，37℃下消化3小时。酶切产物用1％Agarose凝胶电泳分离鉴定。切胶回收目的基因，与载体质粒分别用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系为10μl，含10 X Bufer 1μl，T4连接酶1μl，目的基因和载体DNA按4∶1混匀，16℃连接16小时。实施例7VacA P95基因与载体的酶切与连接用限制性内切酶Nco I和Pst I分别对目的基因片段VacA P95和载体质粒pQE-TriSystem进行双酶切。为防止载体质粒自身环化，用Shrimp碱性磷酸酶处理酶切后的质粒DNA。酶切反应的反应体系为50μl，其中目的基因或载体质粒的DNA 25μl，10 X Buffer 5μl，两种限制性内切酶各1μl，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种预防幽门螺杆菌感染的药物制剂，其特征在于：所述的药物制剂包括尿素酶Ｂ亚单位、空泡毒素、外膜蛋白ＯＭＰ２７和药用佐剂。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：萧树东，史彤，郑青，庞智，朱红音，刘文忠，楼屹，
申请(专利权)人：上海第二医科大学附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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