运用“数据库消减杂交”的方法克隆了一个新的人类睾丸特异性基因ＴＤＲＧ１，它的ｃＤＮＡ全长为１１９７ｂｐ，编码１００个氨基酸。ＴＤＲＧ１基因仅在人睾丸组织中表达，且在青少年睾丸组织中强表达，胎儿和老年睾丸组织中表达明显减弱，表明该基因与男性性成熟与生精功能相关，有望成为诊治男性不育症的新靶点，为开发治疗男性不育症的新药物提供思路。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人类基因，具体是一个新的睾丸特异性基因rZ)i G7的cDNA全 长克隆，并明确了该基因编码的氨基酸序列以及在人体多种组织、不同发育阶段 睾丸组织中的表达谱。技术背景-根据WHO(1986)人类生殖研究发展和培训特别规划署研究报告，在发达国 家不育夫妇占已婚育龄夫妇的15%，而男性不育又占不育夫妇的43%。研究表 明，男性不育发生和发展是一个多基因参与的过程，约2000个不同的基因参与 了男性生殖及其调节过程，包括睾丸发育、生殖细胞分化、减数分裂以及精子 发生的各个阶段。这些基因有的位于性染色体，有的则定位于常染色体。因此， 发现和研究与生精相关的新基因，成为了进一步揭示男性生精过程的分子机制的 关键，也可能为诊治男性不育症提供新的思路。人类基因组图谱公诸于世后，以计算机和互联网为工具，利用现有的表达序 列标签(expressed sequence tag, EST)和生物信息数据库，对人类基因组未知功 能新基因的发掘和蛋白质功能分析己成为近年研究的热点。美国NCBI的 Unigene数据库中拥有大量的EST，它们来源于不同组织、不同细胞、不同病理 状态下所构建的cDNA (complementary DNA)文库，已成为人们寻找新基因的 重要标志物。运用"数据库消减杂交"(Digital Differential Display, DDD)方 法对不同文库进行比较，获得在统计学意义上存在明显差异的代表新基因的克隆 重叠群，并结合实验验证克隆新基因的方法是目前发掘新基因的常用手段之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一个新的睾丸特异性基因rZ)/ G7的的cDNA全长 序列，并明确了其编码的氨基酸序列，分析它在人体多种组织和不同发育阶段睾 丸组织中的表达谱，以探索该基因在睾丸生精过程中所起的作用，进而开发治疗 男性不育症的基因药物。.经互联网进入美国NCBI (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov)的Unigene数据库， 运用DDD方法进行数种平行材料之间的比较。以9个人类睾丸cDNA文库作为 检测子(pool A) ， 76个其他组织或细胞株(如心、脾、肝、肺、脑、皮肤、肾、 卵巢、骨骼肌、胸腺、前列腺、小肠、大肠等)来源的cDNA文库作为驱赶子 (pooffi)，通过poolA: poolB之间的比值来计算倍数差异，并以》10倍的差 异为筛选标准，经数据库消减杂交筛选获得可能存在表达差异的EST片段。选 取了其中一个电子预测其可能在睾丸组织中特异表达的代表新基因的克隆重叠 群(contig)Hs. 180197， i亥EST族中包含BC071820.1、BC033995.2和BC042123.1， 3个序列拼接后获得一条长度为1197 bp的新序列。以拼接后的新序列为探针，运用多种基因预测软件搜索EST和Unigene数据库，经互联网进入美国GenBank数据库，利用BLAST检索nr数据库和EST 数据库进行归类、拼接、延长、査新，获得受人类基因组图谱支持的新基因的 cDNA全长为1197 bp。以成人睾丸组织的总mRNA为模板，进行逆转录。依据电子克隆的新基因 序列设计两对引物(Pi/P2， P3/P4，见下文)在成人睾丸组织的cDNA文库中进 行PCR扩增，以2%琼脂糖电泳检测PCR产物大小。将经琼脂糖电泳验证的PCR 产物连接到pUCm-T载体上，转化大肠杆菌JM109。重组克隆在AB1377-3自动 测序仪上完成测序。结果表明两对引物均扩增成功，实验扩增产物的测序结果与 电子克隆所获得的基因序列完全一致，从而实验验证了该基因在成人睾丸组织中 的表达。对睾丸、心脏、肝脏、脑、附睾、肺、肾、脾等人正常组织进行多组织半定 量RT-PCR分析，结果表明该新基因仅在人睾丸组织中表达。多组织半定量 Northern杂交分析亦显示仅在睾丸组织中有约lJ9kb大小的阳性转录本存在。 说明新克隆的基因为睾丸特异性表达的基因。用半定量RT-PCR分析新基因在人 类不同发育阶段睾丸组织中的表达，发现新基因在4个月和6个月的胎儿睾丸中 无表达，在15岁少年睾丸中强表达，在33岁青年睾丸中表达稍减弱，而在74 岁老年男性睾丸组织中的表达明显减弱，从而提示该基因与男性性成熟与生精功 能有关。因此，我们将该新基因全长cDNA序列提交到GeneBank，登录号为 DQ168992，经国际人类基因命名委员会批准命名为7DWG7 (Testis Development Related Gene 1)。7IJ)i G7基因定位于6p21.1-6p21.2，整个基因跨越约1.8kb，包括2个外显子 和1个内含子。该基因含有303bp (504—806bp)的完整开放阅读框，编码100 个氨基酸，504-506bp处为起始密码子ATG， 804-806bp处为终止密码子TAG, 在ATG 5'端有1个同一相位的终止密码子TGA， 3'端则有1个加尾信号 AATAAA及poly A尾。依据该基因的开放阅读框序列，构建大肠杆菌表达载体重组71J)WG/蛋白， 利用重组蛋白免疫小鼠，制备了抗7Di G/蛋白单克隆抗体。以抗7D7 G/单克 隆抗体为一抗，天然人睾丸组织裂解液为抗原，进行Western Blot检测。结果为 阳性，表明人睾丸组织中有阳性的7Z说G/蛋白表达。7ZWG/蛋白包括100个氨 基酸序列，分子量为17KD，无保守结构域，无跨膜区，无信号肽序列，推测为 一非分泌性蛋白。对其修饰位点预测结果显示可能含有1个蛋白激酶C磷酸 化位点，2个酪蛋白激酶II磷酸化位点，3个N-肉豆蔻基化位点。对该蛋白质 序列进行相似性比较，结果显示与其他已知蛋白质无明显同源性，表明该7Di G7 基因及其编码蛋白质均是全新的。本专利技术的优点1、 克隆了一个人类睾丸特异性新基因的全长cDNA序列，确定了 其编码的氨基酸序列，初步阐明了该基因的功能，为下一步深入研究该基因功能 提供了基础。2、 7Z)i G/基因与男性睾丸生精功能相关，有望成为诊治男性不育症的新靶 点，为开发治疗男性不育症的新药物提供思路。本专利技术通过以下附图和实施例作进一歩阐述，但并不限制本专利技术的范围。 附图说明图1. 7ZW(7/的cDNA核苷酸序列和其编码的氨基酸序列； 图2. RT-PCR实验验证电子克隆的新基因序列；M: Marker; 1:引物P!/P2; 2:引物P3/P4.图3. rZ)A(7/的多组织半定量RT-PCR;M: Marker; 1:睾丸；2:心脏；3:肝；4:脑； 5:附睾；6:肺；7:肾；8:脾.图4. 7ZWG/的多组织Northern杂交；M: Marker; 1:成人脑；2:心脏；3:肝脏；4:月市；5:脾脏；6:肾脏；7:睾丸8:骨骼.图5. ri)i G/在不同发育阶段睾丸组织的半定量RT-PCR;M: Marker; 1: 15岁人睾丸；2: 33岁青年睾丸；3: 74岁老年人睾丸；4: 4个月胎儿睾丸；5: 6个月胎儿睾丸.图6. Western Blot验证7Di G/蛋白； M: Marker;1、 2、 3抗原均为人类睾丸裂解液；抗体均为抗一7I)i本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个新的人类睾丸特异性基因ＴＤＲＧ１，其特征在于该人类新基因的ｃＤＮＡ核苷酸序列和编码氨基酸序列如下： １ ａａｇａｔｃａｇｇａｃｔｇｃｔｇａａａｇａａｔｇａａｇａａｇａａｃｔｔａｃｔｔｇｇｃｃｔａｇｇａｔｇ ５０ ５１ ｔｇｇｃｔａｇａｇａａｃｇｇａｇｃｇｃａｃｔｔｔｃａｃｔｔａｃｃｔｇｇｃａａｇｇｔｇｇｔｔｔｔｇｇａ １００ １０１ ａｇｔｔｔｃｃａｃｇｇａａｇｃｃｔｔｃｃｃａｇｇｇｃｃｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｇｔｃｃｔｃｇｃｃｔａｇｇ １５０ １５１ ｔｇｔｇｇａｇｃｔｔｃｃｃｇａｃｃｇｇｃｔｇｇｇｇａｇｇｇａａｔｇｔｃｃｔｇｃｇｇｇａｇｃｃｇｃｃｇ ２００ ２０１ ａｇｇａｃｃｃｔｃｔｔｔａｇｃｃｔｃｔｔｃｃｃｔｇｇｃｔｔｇｇｃｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｔｃｔｇｇｔａ ２５０ ２５１ ｃｔｃｇｃｃｃａｔｔｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔｔｃａｃｃｔｃｃｇｔａｔｔｔｔｃｔｃｔｃｔｃａｃｇｇａａｇａ ３００ ３０１ ａｇａａｔｔｃｃａｔｔｃｔｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａａｇｇａｇａｇｔｇｃｃｃｔｇｃｇｔｇｃｃａｃｇａａ ３５０ ３５１ ａｇａｇｃｃｃａｇｇａｃｃｃａｃａｇｇａｃａａａｔａｃｇｔｃａｃｔｇｇｃａｇａｃｃｔｇｃｃｔｔｃｇｃ ４００ ４０１ ｃａｇｃｇｃｃａｇｃｃｃａｔｃｔｃｔｇａａａｃｃｔｃｃａｇｃａｔｔｔｇｔｇｃｃｃｃｇｇｔｃｃｇｇｃｃ ４５０ ４５１ ｃｃｔｃｃｃａｇｇｃｃｔｇａｃｔｃｔｔｔｃｃｇｔｇａａｃｇｇｔｃａｃｔｇｃｇｃａｇｇａｔｃａａｇｃｔ ５００ ５０１ ａｃａＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＡＡＣＴ ５５０ Ｍ Ｋ Ｒ Ｒ Ｅ Ａ Ｖ Ｃ Ａ Ｈ Ｒ Ｈ Ｆ Ｌ Ｇ Ｔ ５５１ ＧＧＧＡＡＧＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡ ６０１ Ｇ Ｋ Ｐ Ｐ Ｈ Ｐ Ｌ Ｇ Ｒ Ｓ Ｉ Ｐ Ｖ Ｅ Ｐ Ｃ Ｐ ６０２ ＧＧＣＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴＧＡＴＣＴＡＴＴＧＴＣＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＣＣＡＴＣ ６５２ Ｇ Ｌ Ｐ Ａ Ｆ Ａ Ｅ Ｖ Ｄ Ｌ Ｌ Ｓ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋先镇，阳建福，汤育新，文甲明，
申请(专利权)人：蒋先镇，阳建福，汤育新，文甲明，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。