一种制备萤火虫荧光素酶的方法，是将萤火虫荧光素酶基因插入原核表达载体的多克隆位点，得到含有萤火虫荧光素酶基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入大肠杆菌细胞，得到含有该重组表达载体的重组细胞，培养该重组细胞，表达得到萤火虫荧光素酶。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
荧光素酶(ludfemse)是一种能将化学能转变为光能的高效生物催化剂，萤火虫荧光素酶(简称虫荧光素酶，firefly luciferase， FL)以荧光素(luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和02为底物，在Mg2+存在时，将化学能转化为光能，并发出光量子，反应式如下 luciferaseA丁P + luciferin + Oi^j"^ AMP + PPi + oxyluciferin + CQa + lightATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源。 在其它反应底物均过量存在的情况下，荧光素酶催化发射荧光的数值与ATP的量呈 线性关系。利用这一特性，早在1947年McELroy等就应用FL来测定ATP，此后， 荧光素酶在生物化学及生物技术的分析应用方面得到了不断发展。特别是在细菌检 测方面，由于各生长时期的细菌均有较恒定水平的ATP含量，提取细菌的ATP，利 用生物发光法测定出ATP的含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅需十 几分钟。由于生物发光法无需培养过程、操作简便、灵敏度高，是目前检测微生物 最快的方法之一。荧光素酶由于其具有敏感性高、特异性好、反应迅速、操作简单 和应用范围广等优点，现已成为医学、生物学、环境科学等研究领域中一种新的手 段。因此，对荧光素酶的需求量也日益增加。作为FL生产原料的萤火虫，其人工捕捉或养殖受地域和季节限制，且生产周期 长、养殖成本高、提取的酶成分复杂。随着分子生物学技术的发展，人们转向用基 因工程方法进行生产。1985年，De Wet等首次克隆了北美萤火虫(尸.尸;;rafc)的FL 基因，并在大肠杆菌(五w/zehc/^ co/0中表达，从中得到具有生物活性的FL。随 后，各种发光甲虫的FL基因相继克隆成功，并能在原核和真核表达系统中表达。但 是，目前能够提供FL的厂家主要有Promega、 Sigma和Roche三家国外公司，随着FL 在国内需求量的增加，FL生产的国产化将是大势所趋。大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前应用最广泛的经典表达系 统。它具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短和抗污染能力强等特点，在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术所提供的制备萤火虫荧光素酶的方法，是将萤火虫荧光素酶基因插入原 核表达载体的多克隆位点，得到含有萤火虫荧光素酶基因的重组表达载体，再将该 重组表达载体导入大肠杆菌细胞，得到含有该重组表达载体的重组细胞，培养该重 组细胞，表达得到萤火虫荧光素酶。所述原核表达载体可为pET系列表达载体，如pET28a。 本专利技术中所使用的大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。 上述方法中需要用IPTG诱导萤火虫荧光素酶基因表达，其中，IPTG的浓度为lmmol/L，诱导时间为6h，诱导温度为22"C，摇瓶转速220 r/min，(旋转半径为30匪)。上述方法中还包括将得到的萤火虫荧光素酶进行纯化的步骤。 本专利技术的制备萤火虫荧光素酶的方法具有过程简单、生长周期短、成本低廉、 易于纯化等优点。可缓解虫荧光素酶主要依赖进口的局面，同时可以促进荧光法微 生物快速检测系统的开发以及虫荧光素酶在医学、环境科学等方面的应用，为ATP 生物发光微生物的快速检测以及其它方面的应用提供优质的酶制剂。 附图说明图1为本专利技术的萤火虫荧光素酶的制备方法及检测流程图 图2为虫荧光素酶基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果 图3为重组表达载体的PCR鉴定结果 图4为重组表达载体的酶切鉴定结果 图5为虫荧光素酶的SDS-PAGE纯化结果 具体实施例方式下述实施例中所涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 本专利技术的萤火虫荧光素酶制备过程的具体流程如图1所示。 实施例1、含有萤火虫荧光素酶基因(/wc)的重组表达载体的构建 1、引物设计根据含有北美萤火虫(尸./Vfl&)荧光素酶基因的载体pGEM-luc (购自promega公司)的核苷酸序列，在其开放阅读框的末端加上终止密码子TAA，结合含有His 标签的载体pET28a的多克隆位点与/wc基因的限制性内切酶位点设计引物。在上游 引物的5，端引入AWel酶切位点，在下游引物的5'端引人狄oI酶切位点，引物由上海 生工公司合成，具体序列如下-上游弓I物luc-R: 5，-GGCCGGCATATGGAAGACGCCAAAAAC-3' 下游引物luc-F: 5,-GGCCCTCGAGTTACAATTTGGACTTTCC-3， 2、虫荧光素酶基因(/"c)的PCR扩增以含有/wc基因的载体pGEM-luc (购自promega公司)为模板，进行PCR扩增， 具体的反应体系为10X Buffer5 u 110mM d鮮s4 iil上游引物(50 pmol/y 1)1 Ul下游引物(50 pmol/ul)1 Ul模板DNA0. 1 u 1Taq聚合酶0. 5 u 1灭菌超纯水38. 4 y 1总反应体积50 ul将反应体系混匀，短暂离心后，放入PCR扩增仪(Eppendorf)中，按下列反应 程序进行PCR反应先94。C变性5 min，然后94。C 30s， 55°C 30s， 72°C 1. 5min， 共30个循环，最后72'C延伸10 min， 4'C冷却备用。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道1为PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，M为250bp的丽A分子量标准。3、 重组表达载体的构建将上述步骤2获得的含有/"c基因的PCR扩增产物用限制性内切酶7W/el和J力o[进 行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pET28a (购自Novagen公司)用T4连接酶 进行连接，将得到的含有/wc基因的重组表达载体命名为pET28a-luc。4、 重组表达载体的PCR与酶切鉴定以重组表达载体pET28a-luc为模板，以luc-R和luc-F为引物，进行PCR扩增。对 PC財广增产物l。/。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。其中，泳道1为PCR扩增产物 的琼脂糖凝胶电泳结果，M为250bp的DNA分子量标准。结果表明，扩增得到大小约为1650bp的目的条带。将重组表达载体pET28a-luc用限制性内切酶A^el和J^oI进行双酶切，酶切产物 进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。其中泳道l为重组表达载体pET28a-luc 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果，M为250bp的DNA分子量标准。从图4中可以看出， 重组表达载体pET28a-luc酶切后可以看到两条带， 一条带为载体pET28a，另一条带 为大小约为1650bp的/wc基因。采用T7通用引物对序列进行测定，测序由上海生工生物技术公司完成。测序结 果表明，插入的1650bp的虫荧光素酶基因/wc序列如序列表中序列l所示。实施例2、虫荧光素酶的诱导表达将上述实施例l的重组表达载体pET28a-luc转入大肠杆菌BL21 (DE3)的感受态细 胞中；挑取单菌落，接种于2ml含有终浓度为5(^g/ml卡那霉素的LB培养液中，37°C 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备萤火虫荧光素酶的方法，是将萤火虫荧光素酶基因插入原核表达载体的多克隆位点，得到含有萤火虫荧光素酶基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入大肠杆菌细胞，得到含有该重组表达载体的重组细胞，培养该重组细胞，表达得到萤火虫荧光素酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林金明，肖勤，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11
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