基于转录组测序开发的花椰菜SSR引物制造技术

本发明专利技术提供基于转录组测序开发的花椰菜SSR引物，包含17对引物，引物序列如SEQ ID NO.1‑34所示。本发明专利技术利用花椰菜转录组测序获得的大量转录本数据信息，开发大量的 SSR 引物，并利用本课题组收集的代表性种质资源对开发的 SSR 标记进行有效性验证，为后续的花椰菜遗传多样性研究、基因组比较研究、遗传图谱构建、重要性状的QTL定位、核心资源的利用和保存、分子辅助育种等方面奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
基于转录组测序开发的花椰菜SSR引物
本专利技术属于生物
，具体涉及基于转录组测序开发的花椰菜SSR引物。
技术介绍
花椰菜（BrassicaoleraceaL.var.botrytisL.,2n=2x=18）是十字花科芸薹属中以花球为食用器官的甘蓝类蔬菜，原产于地中海沿岸（刘运霞，2011）。花椰菜在我国福建、浙江、湖北等地区均有种植，是我国非常重要的蔬菜之一。花椰菜因营养丰富，有抗癌防癌功效，作为药食兼用的保健型蔬菜，需求量不断增加，种植面积不断扩大（朱世扬等，2012）。据报道，我国花椰菜在栽培面积和产量上居于世界首位（李文萍等，2014）。我国花椰菜育种研究起步较晚。品种资源是育种研究的基础，鉴定和分析花椰菜品种间的遗传关系是品种选育的必不可少的关键步骤。DNA标记技术是生物学领域在分子水平上研究蔬菜遗传多样性的重要辅助方法。为了从分子层面上研究花椰菜的遗传多样性，近年来许多科研工作者应用AFLP(李志琪，2003)、RAPD(林珲，2007；田源，2007)、InDel(刘运霞，2011)、ISSR（马二磊等，2010）、SRAP(楼钰等，2015；姚雪琴等，2016)等开展研究工作。关于SSR标记在花椰菜上研究报道较少，仅是王冬梅和刘运霞等（王冬梅，2011；刘运霞，2011）根据近缘物种引物的通用原理，利用甘蓝开发的EST-SSR标记开展花椰菜亲缘关系的鉴定。SSR（simplesequencerepeat，微卫星序列即简单重复序列）分子标记技术是一种具有操作简单、重复性好、共显性高、稳定性好、位点特异等优点的DNA分子标记，在真核和原核生物中应用广泛（Tuleretal.，2015）。根据它的来源，可分为基因组SSR(g-SSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)。传统的SSR标记的开发是通过基因组或下载EST序列，根据基因序列的两侧保守区域来设计SSR引物，工作量大、时间长、花费高昂（Zhangetal.，2012），并且NCBI数据库中的花椰菜EST序列数量有限，可开发的SSR引物数量不多。随着分子生物学技术的飞速发展，高通量转录组测序技术可以在无参考基因组的情况下，获得某个物种的大量转录本信息，利用生物信息学软件开发大量的SSR引物，具有迅速高效、花费合理、数据可靠等优点。目前，通过转录组测序平台开发SSR标记已经在大白菜（Dingetal.，2015）、萝卜（Zhaietal.，2014）、辣椒（刘峰等，2012）、茄子（魏明明等，2016）、南瓜（Wuetal.，2014）、菜薹（李荣华等，2016）、洋葱（李满堂等，2015）、菠菜（潜宗伟等，2016）等蔬菜中得到应用。本研究利用花椰菜转录组测序获得的大量转录本数据信息，开发大量的SSR引物，并利用本课题组收集的代表性种质资源对开发的SSR标记进行有效性验证，为后续的花椰菜遗传多样性研究、基因组比较研究、遗传图谱构建、重要性状的QTL定位、核心资源的利用和保存、分子辅助育种等方面奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供基于转录组测序开发的花椰菜SSR引物，为后续的花椰菜遗传多样性研究、基因组比较研究、遗传图谱构建、重要性状的QTL定位、核心资源的利用和保存、分子辅助育种等方面奠定基础。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：所述引物包含17对引物，引物序列如SEQIDNO.1-34所示。具体如下表：17对花椰菜SSR引物信息本专利技术的优点在于：本专利技术对花椰菜开展转录组测序研究，获得66450条unigene序列，含有10715个SSR位点，发生频率为12.09%，平均分布距离为5.9kb。SSR位点中主导类型为二核苷酸重复基序，占总SSR的51.16%；其次是三核苷酸重复基序，其出现频率为47.37%。重复序列的基序共49种，其中出现频率较高的重复基序主要为AG/CT、GA/TC和GAA/TTC。重复序列的SSR长度≥20bp有1164个，设计出6119对具有潜在高多态性的SSR引物组合。随机筛选40对SSR引物进行PCR扩增，31对引物能进行有效扩增，17对引物在24份花椰菜品种中表现出多态性。UPGMA分析显示，17对多态性引物可将24份花椰菜分为3类。本专利技术开发的花椰菜SSR标记类型丰富，出现频率高，具有较高的可用性，为花椰菜品种遗传关系鉴定、绘制遗传图谱等提供候选标记。附图说明图1引物有效性扩增验证。其中，M为Maker，1-40泳道为引物1-40的PCR扩增产物。图2引物1在24个花椰菜材料中的多态性。M为Maker，其他各品种编号名称见表1。图3供试花椰菜材料的UPGMA聚类图。具体实施方式1材料与方法1.1转录组数据来源花椰菜转录组数据来源于本课题花椰菜高通量转录组深度测序。测序时，取花椰菜花梗置于液氮中速冻保存，后干冰低温快递至北京百迈克公司RNA-Seq转录组测序，共有15.58Gb的数据量，包含66450条unigene作为分析背景数据。1.2植物材料及其DNA提取用于对所设计的引物进行筛选和验证的材料为本课题组收集和保存的24份花椰菜品种（表1）。采用改良的CTAB法提取花椰菜DNA（林珲等，2015）。用Trizol试剂（Invitrogen，USA）提取各材料的总RNA（Guoetal.，2009）。表1花椰菜SSR多态性分析材料1.3转录组SSR位点鉴别及引物设计使用MISA软件对花椰菜转录组数据进行SSR位点搜索，搜索标准为：重复基序长度在2~6bp，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为6、5、5、4和4次。用批量设计软件Primer3.0对1kb以上含有SSR位点的unigene进行引物设计。引物设计的依据原则为：（1）引物长度在18~25bp之间；（2）PCR产物大小在100~300bp；（3）退火温度（Tm）在55~65℃之间，上、下游引物的Tm相差≤2℃；（4）GC含量在40%~60%之间；（5）尽量避免引物二级结构如发卡结构、二聚体、错配、引物二聚体的出现（李翠婷等，2014）。每个SSR位点产生3对引物。从设计的引物中随机挑选出40对引物序列，由上海铂尚生物技术有限公司合成。1.4PCR扩增在20μL的PCR反应总体积中，含100ng·μL-1的DNA模板1.5μL，10×PCRBuffer2.5μL，10μmol·L-1正向引物1μL，10μmol·L-1反向引物1μL，10mmol·L-1，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶（5U·μL-1）0.3μL，ddH2O9.7μL。PCR扩增在ABI9700PCR仪（AppliedBiosystems，USA）上进行，扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃下保存。电泳后观察拍照检测PCR扩增产物。1.5数据统计采用人工读带的方法，将电泳图上可重复的、清晰的条带记为“1”，同一位置无带或不易分辨的弱带计为“0”，利用EXCEL表格建立原始数据矩阵。利用软件DPS计算每对引物扩增位点的等位位点数、多态性信息量、遗传距离，按UPGMA进行聚类绘图。2结果与分析2.1花椰菜转录组中的SSR位点的数量与分布应本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于转录组测序开发的花椰菜SSR引物，其特征在于：所述引物包含17对引物，引物序列如SEQ ID NO.1‑34所示。

【技术特征摘要】
1.基于转录组测序开发的花椰菜SSR引物，其特征在于：所述引物包含17对引物，引物序列如SEQIDNO.1-34...

【专利技术属性】
技术研发人员：林珲，朱海生，李永平，陈敏氡，温庆放，薛珠政，叶新如，
申请(专利权)人：福建省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35