一种提高蛹虫草菌液体发酵虫草素产量的方法技术

一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，步骤为：将菌株转接于无菌PDA斜面培养基上进行培养、活化，得斜面母种；斜面母种转接至平皿培养基培养，得平板母种；平板母种接种至种子培养基，摇床培养，得种子液；种子液接种至优化培养基并用无菌聚丙烯袋封住三角瓶口，摇床培养，得待补料发酵液；依据腺嘌呤补料公式配制腺嘌呤补料溶液，向待补料发酵液添加100mL腺嘌呤补料溶液,使得发酵液腺嘌呤达到其优化质量浓度，得已补料发酵液；将已补料发酵液于摇床培养后，继续静置培养，得含菌丝体的发酵液；将含菌丝体的发酵液中的菌丝体滤除，得虫草素发酵滤液。其工艺简单、无污染、虫草菌发酵液虫草素产量高达956.020 µg/mL。

【技术实现步骤摘要】
一种提高蛹虫草菌液体发酵虫草素产量的方法
本专利技术涉及真菌发酵
，具体地说是一种提高蛹虫草菌液体发酵虫草素产量的方法。
技术介绍
虫草素（Cordycepin）即3’脱氧腺苷，为嘌呤类生物碱，具有抗病毒、消炎、抑制肿瘤和提高机体免疫力等功效。此外，虫草素通过ROS介导的细胞凋亡途径治疗T淋巴细胞白血病，其作为治疗T淋巴细胞白血病新药的研究已进入临床二期实验。而虫草素的产生菌主要为虫草属真菌，此外，无冠构巢曲霉亦可产生虫草素，但蛹虫草菌Cordycepsmilitaris发酵液中虫草素含量高于其他真菌。近年来，温度、光照、溶氧量、pH值、碳氮源等提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的研究很多，但利用微量添加物的补料策略提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的研究很少，而腺嘌呤和腺苷为虫草素生物合成的直接前体物质，对提高发酵液虫草素产量的作用显著，腺嘌呤比腺苷更容易通过细胞膜，使得细胞利用腺嘌呤合成虫草素的效率更高。然而，优化腺嘌呤补料策略提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的研究更少。如专利申请号为201610578793.4的中国专利技术专利申请所公开的《一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法》、《食品科技,》2013,38（7）所公开的《甘氨酸补加产虫草素的蛹虫草液体发酵条件的优化》均未进行腺嘌呤的补料，发酵液虫草素产量的提高程度较低，最高只有238.52％。专利申请号为200810069010.5的中国专利技术专利申请所公开的《一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法》联合添加腺嘌呤和甘氨酸，使得虫草素产量比对照提高了426%，但没有优化腺嘌呤和甘氨酸的联合添加浓度，同时也未进行腺嘌呤的补料。专利申请号为201510233106.0的中国专利技术专利申请公开了《一种虫草素发酵固体培养基及其制备方法与应用》，采取联合补料腺嘌呤和脂肪酸甘油酯提高固体培养基蛹虫草素产量，即未优化腺嘌呤的联合添加浓度，也未依据腺嘌呤的优化浓度进行精确补料，而且其采用的添加方式易造成发酵污染，进而影响虫草素产量的提高，增加了生产成本。专利申请号为201611245510.0、名称为《一种提高蛹虫草液态发酵生产虫草素和耐热蛋白酶产量的方法》的中国专利技术专利申请，利用营养液和复合激活剂多次补料以提高虫草素产量，但未对复合激活剂组分的添加浓度进行优化，亦未根据复合激活剂的优化浓度进行补料，易增加生产成本且工艺较复杂。在“甘肃省科技计划资助”（资助项目编号：17JR5RA181）的资助下，以及“甘肃省科学院应用研究与开发项目”（项目编号：2017JK-14）协助支持下，本专利技术深入研究了提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，并获得成功。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，克服现有技术蛹虫草菌发酵液虫草素产量提高程度低、补料不精准、补料易污染和补料工艺复杂的技术缺陷。一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：使用的菌株为中国微生物菌种保藏中心的蛹虫草菌（Cordycepsmilitaris）CGMCC3.4655；按照下述步骤进行：（1）将菌株转接于无菌PDA斜面培养基上进行培养、活化，制得斜面母种；（2）将斜面母种转接至平皿培养基培养，制得平板母种；（3）将平板母种接种至种子培养基，摇床培养，制得种子液；（4）将种子液接种至优化培养基并用无菌聚丙烯袋封住三角瓶口，摇床培养，制得待补料发酵液；（5）依据腺嘌呤补料公式配制腺嘌呤补料溶液，向待补料发酵液添加100mL腺嘌呤补料溶液,使得发酵液腺嘌呤达到其优化质量浓度，制得已补料发酵液；（6）将已补料发酵液于摇床培养后，继续静置培养，静置培养结束后制得含菌丝体的发酵液；（7）将含菌丝体的发酵液中的菌丝体滤除，收集滤液，制得虫草素发酵滤液。上述步骤（1）的斜面母种制作中，PDA斜面培养基为公知培养基。上述步骤（2）的平板母种制作中，平皿培养基组方为：由蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g与琼脂15g组成的营养琼脂33g与纯净水1000mL混匀，pH7.3±0.1；方法：从斜面母种取3mm大小菌块，接种至平皿培养基，于黑暗、20℃培养9d，制得平板母种。上述步骤（3）的种子液制作中，种子培养基组方为：葡萄糖30g、蛋白胨8g、酵母粉8g、KH2PO41g与水1000mL混匀，pH自然；方法：无菌条件下用打孔器取平板母种同一半径上3mm大小的6个菌块接种至种子培养基装载量为300mL/500mL的三角瓶中，于25℃、黑暗、120r/min摇床培养3d制成种子液。上述步骤（4）的待补料发酵液制作中，优化培养基组方为：葡萄糖35g、蛋白胨17g、腺嘌呤2g、甘氨酸14g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O1g与纯净水1000mL混匀，pH自然；方法：无菌条件下将种子液以体积比5%（优化培养基装载量200mL的5%）接种量接种至优化培养基装载量200mL/500mL的三角瓶中，用无菌聚丙烯袋封住三角瓶瓶口，于黑暗、25℃、160r/min摇床培养12d，制得待补料发酵液。上述步骤（5）的已补料发酵液制作中，腺嘌呤补料参数：腺嘌呤补料溶液的质量浓度按照腺嘌呤补料公式计算，每个待补料发酵液添加腺嘌呤补料溶液的体积为100mL；方法：将步骤（4）装有待补料发酵液的三角瓶从摇床取出并置于超净工作台，无菌条件下，取下三角瓶瓶口的聚丙烯袋和瓶塞后，将装载量100mL/150mL的无菌腺嘌呤溶液倒入待补料发酵液，制成已补料发酵液。上述步骤（6）的含菌丝体的发酵液制作中，摇床培养条件为黑暗、25℃、160r/min、培养6d，静置培养条件为黑暗、25℃、培养6d。上述步骤（7）的虫草素发酵滤液制作方法为：含菌丝体的发酵液经0.22µm滤膜滤除菌丝体，收集滤液，即得虫草素发酵滤液。以上方法中，腺嘌呤补料溶液、聚丙烯袋和各培养基均在0.15MPa条件下灭菌30min。以下为本专利技术的主要实验设计和相关说明：本专利技术涉及的发酵液虫草素产量、腺嘌呤剩余量、pH值和体积所指为发酵滤液的相关指标。HPLC法测定发酵液虫草素产量条件：美国Waters1525高效液相色谱；色谱柱：ZorbaxSBC18柱（4.6mm×250mm，5µm）；流动相：甲醇:水15∶85（V/V）；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量：20µL；检测波长：260nm。上述步骤（4）已对甘氨酸和腺嘌呤的添加质量浓度的进行了优化，发现腺嘌呤和甘氨酸的优化添加质量浓度分别为2g/L和14g/L，实验结果如图1和图2所示。实验方法为：设置基础培养基的腺嘌呤添加质量浓度梯度为0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L，对照不添加腺嘌呤，于黑暗、25℃、160r/min条件下摇床培养6d，以发酵液虫草素产量为指标筛选腺嘌呤的优化质量浓度；利用腺嘌呤优化质量浓度，设置基础培养基中甘氨酸和腺嘌呤质量浓度比值分别为：0∶1、1∶1、4∶1、7∶1、10∶1、13∶1，发酵液虫草素产量为指标筛选腺嘌呤和甘氨酸联合添加的优化质量浓度。其中，基础培养基组方：葡萄糖35g、蛋白胨17g、腺嘌呤2g、甘氨酸14g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O1g、pH自然、纯净水1000mL。上述步骤（4）筛选补料时间的实验方法：设置16个发酵实验，其中1个作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：用中国微生物菌种保藏中心的蛹虫草菌（

【技术特征摘要】
1.一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：用中国微生物菌种保藏中心的蛹虫草菌（Cordycepsmilitaris）CGMCC3.4655；按照下述步骤进行：（1）将菌株转接于无菌PDA斜面培养基上进行培养、活化，制得斜面母种；（2）将斜面母种转接至平皿培养基培养，制得平板母种；（3）将平板母种接种至种子培养基，摇床培养，制得种子液；（4）将种子液接种至优化培养基并用无菌聚丙烯袋封住三角瓶口，摇床培养，制得待补料发酵液；（5）依据腺嘌呤补料公式配制腺嘌呤补料溶液，向待补料发酵液添加100mL腺嘌呤补料溶液,使得发酵液腺嘌呤达到其优化质量浓度，制得已补料发酵液；（6）将已补料发酵液于摇床培养后，继续静置培养，静置培养结束后制得含菌丝体的发酵液；（7）将含菌丝体的发酵液中的菌丝体滤除，收集滤液，制得虫草素发酵滤液。2.如权利要求1所述的一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（2）所述的平皿培养基，其组方为：由蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g与琼脂15g组成的营养琼脂33g与纯净水1000mL混匀，pH7.3±0.1；方法为：从斜面母种取3mm大小菌块，接种至平皿培养基，于黑暗、20℃培养9d，制得平板母种。3.如权利要求1所述的一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（3）所述的种子培养基，其组方为：葡萄糖30g、蛋白胨8g、酵母粉8g、KH2PO41g与水1000mL混匀，pH自然；方法为：无菌条件下用打孔器取平板母种同一半径上3mm大小的6个菌块接种至种子培养基装载量为300mL/500mL的三角瓶中，于25℃、黑暗、120r/min摇床培养3d制成种子液。4.如权利要求1所述的一种提高蛹虫草菌发酵液虫草素产量的方法，其特征在于：步骤（4）所述的优化培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦鹏，王龙，路等学，郭瑞，赵玉卉，韩融冰，丁品，
申请(专利权)人：甘肃省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62