一种通过流加骨蛋白胨提高腺苷产量的方法技术

本发明专利技术提供一种通过流加骨蛋白胨提高腺苷产量的方法。该方法以枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)SL03为生产菌株，包括菌种斜面培养、种子培养和发酵培养的过程，所述的发酵培养是指分批流加骨蛋白胨发酵培养。即在产苷阶段流加补充氮源骨蛋白胨，大大提高了腺苷发酵的产量。随着发酵过程的进行，发酵培养基中氮源浓度降低，菌体生长和产苷条件变化，利用本发明专利技术中的流加方法，可以一定程度上维持氮源的充足，产量较对比例提高8.3％‑20％，发酵周期由原来的50h缩短至42h。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种通过在发酵过程流加骨蛋白胨以提高腺苷产量的分批式补料发酵方法。背景方法腺嘌呤核苷(Adenosine)，也称为腺苷，商品名为AR，化学名称为9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤(9-β-D-ribofuranosyladenine)，分子式为C10H13N5O4、分子量为267.24。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷还对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用，是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体，在医药市场上具有广阔的开发前景。腺苷的主要生产方法有化学合成法、酶法和发酵法等。前两种方法由于成本高，污染大，大规模应用受到一定程度的限制。而发酵法自1968年，日本小西真八等人开始，经历很多研究学者的努力，如今已进入大规模工业化生产阶段。国内腺苷发酵起步稍晚，与国外相比，仍然存在产量较低等问题。因此，在发酵生产腺苷时，优化发酵工艺，进一步提高腺苷产量，显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术目的在于解决发酵法生产腺苷产量较低的问题，提供一种通过流加骨蛋白胨提高腺苷产量的方法。该方法通过在发酵中后期匀速补入氮源，为菌体生长和发酵产苷提供了营养物质，保持了发酵产苷的活力和稳定性，提高了最终的发酵产量。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种通过流加骨蛋白胨提高腺苷产量的方法，发酵菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)SL03，为本公司通过菌种优化得来。本专利技术方法的具体操作步骤包括：(1)斜面培养：将枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)SL03接种至活化斜面，28～32℃，培养20～28h；(2)种子培养：用接种环取一环斜面菌种，接种至种子培养基，28～32℃，180～220rpm，培养8～12h，作为发酵种子液；(3)分批发酵培养：按10～15％的移种量移种至装有灭菌发酵培养基的发酵罐中，发酵温度为35～37℃，发酵过程通过流加NH3·H2O维持pH6.0～6.5，溶氧维持在20～30％，培养时间40～50h。菌体OD(600*20)达到0.4～0.5以上时，例如12～30h，开始匀速流加骨蛋白胨，共流加两次，合100～200mL。OD(600*20)表示菌体生物量测定，使用721型号分光光度计，在波长600nm时稀释20倍进行测定。其中，所述的斜面培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖2～3，胰蛋白胨8～10，牛肉膏8～10，酵母粉3～5，NaCl1.5～2.5，琼脂20～30，pH7.0～7.2。所述的种子培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖10～20，酵母粉5～10，KH2PO40.5～1.5，MgSO4·7H2O0.2～0.8，次黄嘌呤0.01～0.05，鸟嘌呤0.01～0.015，味精3～8，尿素1～2，玉米浆10～20mL/L，pH7.0～7.2。所述的发酵培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖100～150，酵母粉20～30，K2HPO42～3，(NH4)2SO410～15，MgSO4·7H2O1～2，次黄嘌呤2～2.5，鸟嘌呤1～1.5，味精20～30，MnSO40.003～0.006，FeSO4·7H2O0.003～0.006，玉米浆10～20mL/L，豆粕水解液10～20mL/L。综上所述，本专利技术以枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)SL03为发酵菌株，对发酵过程进行进一步优化，在5L发酵罐上分批流加骨蛋白胨，提供了菌体生长所需要的氮源物质，同时使得腺苷产量大幅提高。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果在于：通过在发酵过程分批流加骨蛋白胨，提供了菌体生长所需要的氮源物质，维持了菌体生长代谢的强度，与非流加时相比，腺苷产量提高了8.3％-20％。具体实施方式下面通过实例进一步说明本专利技术。本专利技术实例的配方和制备方法是用于说明本专利技术，而不是对本专利技术的限制，在本专利技术的构思前提下有关双氯芬酸钠肠溶片的配方及制备方法的简单改进都属于本专利技术要求保护的范围。以下各实施例中发酵产物腺苷含量所采用的分析方法如下：发酵液中腺苷含量采用纸层析法分离测定。发酵液经离心机离心8000rpm，15min，所得上清液用纸层析分离后在260nm处测紫外吸收值(A260)。所述纸层析的层析液配比为，硫酸铵：氨水：水等于(1～1.5):(2～3):(7～8)。所述硫酸铵浓度≥99％，氨水的浓度为25％～28％。精确称取腺苷的标准品，用去离子水配置成质量浓度为1g/L的标准品溶液；将待测发酵上清液样品用去离子水稀释至适当的浓度，同标准品一起进行纸层析检测。实施例1斜面培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖2，胰蛋白胨8，牛肉膏8，酵母粉3，NaCl1.5，琼脂25，pH7.0。种子培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖10，酵母粉10，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O0.6，次黄嘌呤0.03，鸟嘌呤0.01，味精5，尿素1.5，玉米浆20mL/L，pH7.0。发酵培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖120，酵母粉20，K2HPO42.5，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O1.5，次黄嘌呤2，鸟嘌呤1.5，味精25，MnSO40.003，FeSO4·7H2O0.003，玉米浆20mL/L，豆粕水解液10mL/L。以枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)SL03为出发菌株，接种至斜面进行活化，30℃培养24h，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，30℃，200rpm培养12h；按10％(v/v)的接种量转接至装有发酵培养基的5L发酵罐中，36℃，溶氧维持在20～30％，发酵过程通过流加NH3·H2O维持pH6.5，并且在线监测发酵液中葡萄糖残留量，当其下降至为10g/L，流加葡萄糖至发酵液维持残糖量为10g/L；发酵至12h和24h，分别匀速流加5g/L骨蛋白胨溶液，流加2次，每次100mL，总流加量为200mL，发酵42h，腺苷产量达到40.5g/L。实施例2斜面培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖2.5，胰蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉3，NaCl2，琼脂20，pH7.2。种子培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖15，酵母粉10，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O0.8，次黄嘌呤0.05，鸟嘌呤0.015，味精3，尿素2，玉米浆15mL/L，pH7.0。发酵培养基成分包括(以g/L计)：葡萄糖150，酵母粉30，K2HPO42，(NH4)2SO412，MgSO4·7H2O2，次黄嘌呤2.5，鸟嘌呤1，味精20，MnSO40.005，FeSO4·7H2O0.005，玉米浆15mL/L，豆粕水解液15mL/L。以枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)SL03为出发菌株，接种至斜面进行活化，28℃培养24h，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，32℃，180rpm培养11h；按10％(v/v)的接种量转接至装有发酵培养基的5L发酵罐中，37℃，溶氧维持在20～30％，发酵过程通过流加NH3·H2O维持pH6.0，并且本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过流加骨蛋白胨提高腺苷产量的方法，包括菌种斜面培养、种子培养和发酵培养的过程，其特征在于：所述的发酵培养是指分批流加骨蛋白胨发酵培养。

【技术特征摘要】
1.一种通过流加骨蛋白胨提高腺苷产量的方法，包括菌种斜面培养、种子培养和发酵培养的过程，其特征在于：所述的发酵培养是指分批流加骨蛋白胨发酵培养。2.根据权利要求1所述的流加骨蛋白胨提高腺苷产量的方法，其特征在于：所述的菌种斜面培养是指将枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)SL03接种至活化斜面，28～32℃，培养20～28h。3.根据权利要求2所述的流加骨蛋白胨提高腺苷产量的方法，其特征在于：所述的种子培养是用接种环取一环斜面菌种，接种至种子培养基，28～32℃，180～220rpm，培养8～12h，作为发酵种子液。4.根据权利要求3所述的流加骨蛋白胨提高腺苷产量的方法，其特征在于：所述分批流加骨蛋白胨发酵培养是指将种子液按10～15％的移种量移种至装有灭菌发酵培养基的发酵罐中，发酵温度为35～37℃，发酵过程通过流加NH3·H2O维持pH6.0～6.5，溶氧维持在2...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡丽芳，黄名燕，余宇坚，
申请(专利权)人：广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，肇东星湖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44