本发明专利技术公开了一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法，包括菌种活化、蛹虫草菌种制作、蛹虫草培养，液体菌种制作的过程中采用孢子浓度3.0×108CFU/mL或者4‑5块菌饼时制作的母种作为蛹虫草菌种扩大培养中的一级种子液；蛹虫草培养过程中采用的发酵培养基包含葡萄糖25g/L，土豆100g/L，鱼蛋白胨18g/L，(NH4)2SO4 0.8g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蚕蛹粉5.0g/L，VB1 18mg/L，水1L。通过本发明专利技术蛹虫草生物量提高了74.51％，虫草菌素总产量提高了238.52％。本发明专利技术对蛹虫草生物量和蛹虫草产虫草素能力有显著的促进作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及真菌发酵
，具体是一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法。
技术介绍
蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种。学名为Cordycepsmilitaris，又名北冬虫夏草、北虫草等，有部分地区亦称为踊虫草，世界性分布天然资源数量很少。虫草菌素是冬虫夏草和蛹虫草中(尤其是核苷类)主要活性成分，也是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素。虫草素一种天然来源的药物，具有中医医理中冬虫夏草一样的阴阳同补和双向调节人体平衡的功能；它在护肝、保肾、润肺方面由于成分更纯效果更好，而且大补气血，能消除现在不能治愈的痛经、偏头痛、颈椎增生等疾病。从西医医理角度看虫草素具有抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用，有良好的临床应用前景。目前虫草素的研究现正成为药物化学、抗衰老、美容、保健品领域中一个极其活跃的领域。蛹虫草的培养大多集中在固体培养的研究，对于液体培养涉及的比较少，且涉及到的液体培养产量低，无法满足市场需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法，对蛹虫草生物量和蛹虫草产虫草素能力有显著的促进作用。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法，包括菌种活化、蛹虫草菌种制作、蛹虫草培养，液体菌种制作的过程中采用孢子浓度3.0×108CFU/mL或者4-5块菌饼时制作的母种作为蛹虫草菌种扩大培养中的一级种子液；蛹虫草培养过程中采用的发酵培养基包含葡萄糖糖、土豆、鱼蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蚕蛹粉、VB1和水。作为本专利技术进一步的方案：发酵培养基中各成分的含量为：葡萄糖25g/L，土豆100g/L，鱼蛋白胨18g/L，(NH4)2SO40.8g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蚕蛹粉5.0g/L，VB118mg/L，水1L。作为本专利技术进一步的方案：蛹虫草菌种采用NS-810菌株。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：通过本专利技术优化后蛹虫草生物量和虫草菌素总产量都要比未优化的高得多，优化后蛹虫草生物量提高了74.51％，虫草菌素总产量提高了238.52％。本专利技术对蛹虫草生物量和蛹虫草产虫草素能力有显著的促进作用。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1本专利技术实施例中，为了获得蛹虫草液体一级种制备和液体发酵生产虫草菌素的最佳工艺，以蛹虫草Cordyceps militaris(L)link.NS-810菌株为菌种，通过对接种量(孢子浓度和菌饼数量)的考察，探索不同孢子浓度和菌饼数对蛹虫草液体一级种制作效果的影响；通过单次单因子和正交试验，优化蛹虫草深层发酵产虫草素的最佳培养基。具体描述如下：1材料与方法1.1菌种与培养基蛹虫草[Cordyceps militaris(L)link.]分离自四川省甘孜藏族自治州九龙县瓦灰山自然保护区采集的蛹虫草鲜标本，命名为蛹虫草NS-810，经驯化保存于四川省高等学校特色农业资源研究与利用重点实验室。菌种活化培养基(PDA)：葡萄糖20g，土豆200g，鱼蛋白胨5g，水1L；蛹虫草液体母种培养基：葡萄糖20g，土豆200g，蛋白胨5g，KH2PO4 2g，MgSO4.7H2O 1.5g，水1L，112℃灭菌30min；蛹虫草发酵基础培养基：葡萄糖20g，土豆200g，蛋白胨10g，KH2PO4 2g，MgSO4.7H2O 1.5g，水1L，112℃灭菌30min。1.2试剂与仪器虫草菌素标准品购于美国Sigma公司；鱼蛋白胨(工业级)购于上海缘肽生物技术有限公司；Agilent 1100分析型高效液相色谱仪美国安捷伦公司；50L发酵罐江苏丰泽生物工程设备制造有限公司。1.3方法1.3.1供试菌株的活化将采用打孔器(直径D＝10mm)将蛹虫草菌饼接于PDA培养皿(15mL PDA培养基)中央上，倒置于26℃人工气候箱中培养5d，4℃冰箱保存备用。1.3.2蛹虫草液体菌种制备的优化(1)不同蛹虫草菌饼的接种对液体菌种的影响，用打孔器在活化蛹虫草菌体的外缘取菌饼，不同数量的菌饼接种到蛹虫草液体种培养基中：2块、3块、4块、5块、6块、7块；(2)将NS-810菌株孢子悬液进行稀释，在显微镜下通过血球计数板计数，并制作一系列不同的孢子浓度梯度。然后将蛹虫草液体种培养基调到如下孢子浓度：2.0×105、2.0×106、2.0×107、2×108、2.5×108、3×108、3.5×108、4×108CFU/mL；150r/min，21℃振荡培养，从第2天到5天连续观察不同数量菌块接种后液体一级菌种菌丝球的形态、大小、数量及发酵液的状态变化，每个处理3个重复。1.3.3种子液制备将NS-810菌株孢子悬液进行稀释，然后按孢子浓度为3×108CFU/mL或者用打孔器取得蛹虫草菌饼4-5块接种液体母种培养基(装液量为50mL/250mL)中，140r/min，21℃振荡培养4d，再10％(v/v)接种量将种子液接入发酵摇瓶(装液量为50mL/250mL)中，140r/min，21℃振荡培养12d，每个处理3个重复。13.4接种并深层发酵同以10％的接种量转到500mL三角瓶中，140r/min，21℃振荡培养4-5d作为发酵罐接种物。50L发酵罐中培养基体积40L，接种量5％，发酵温度24℃，通气量:1.25m3/h，搅拌培养10d转速为140r/min，然后再静置培养2天。1.4测定方法将蛹虫草液体培养物于低速大容量多管离心机4000r/min离心10min获得菌丝体，用蒸馏水冲洗菌丝体3次，于干燥箱中60℃烘干至恒重，称量；菌丝体和发酵液中虫草菌素的测定采用HPLC色谱法，参照刘桂君等在食品科学中发表的蛹虫草中虫草素的研究进展中的方法并进行了优化，HPLC色谱条件：Extend-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇:水(82∶18)，流速：1.0mL/min，检测波长：260nm，柱温：30℃。计算公式：虫草菌素总产量(mg/L)＝[胞外虫草菌素质量(mg)+胞内虫草菌素质量(mg)]/发酵液体积(L)。每个处理3个重复，取其平均值。1.5液体发酵培养基配方的优化以下各项试验均以菌丝体的生物量和从虫草素的产量为考察指标，每项试验中的每个处理3个重复。1.5.1速效碳源选择在液体发酵培养基中分别采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇作为速效碳源(速效碳源的浓度均为20g/L)，其他组分与蛹虫草发酵基础培养基相同，以不加速效碳源的蛹虫草发酵基础培养基作为对照。1.5.2缓效碳源选择在液体发酵培养基中分别采用土豆(质量浓度分别为100g/L、200g/L和300g/L)、玉米粉(质量浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L)和可溶性淀粉(质量浓度分别为10g/L本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法，包括菌种活化、蛹虫草菌种制作、蛹虫草培养，其特征在于，液体菌种制作的过程中采用孢子浓度3.0×108CFU/mL或者4‑5块菌饼时制作的母种作为蛹虫草菌种扩大培养中的一级种子液；蛹虫草培养过程中采用的发酵培养基包含葡萄糖糖、土豆、鱼蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蚕蛹粉、VB1和水。
【技术特征摘要】
1.一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法，包括菌种活化、蛹虫草菌种制作、蛹虫草培养，其特征在于，液体菌种制作的过程中采用孢子浓度3.0×108CFU/mL或者4-5块菌饼时制作的母种作为蛹虫草菌种扩大培养中的一级种子液；蛹虫草培养过程中采用的发酵培养基包含葡萄糖糖、土豆、鱼蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蚕蛹粉、VB1和水。2.根据权利要求1所述的提高蛹虫草液...
【专利技术属性】
技术研发人员：张楠，段辉国，唐正义，黎勇，徐洁，熊茂，雷雨田，
申请(专利权)人：内江师范学院，
类型：发明
国别省市：四川;51
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。