一种从蛹虫草培养基中提取及连续富集多糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种从蛹虫草培养基中提取及连续富集多糖的方法，步骤包括蛹虫草大米残余培养基的干燥、超微粉碎、生物多酶体系酶法水解、离心过滤、回流控制、多功能膜浓缩富集、喷雾干燥、定性定量，建立了一条虫草多糖的快速、高效、经济的分离方法。本发明专利技术利用酶法等绿色提取技术联合功能型膜分离技术制备虫草多糖，即保证了虫草多糖的纯度和品质，又实现了快速富集浓缩，并保证了多糖的生物活性。本发明专利技术有效的利用了废弃的蛹虫草培养基，节约了资源和成本。本发明专利技术适合大规模工业化生产。通过本发明专利技术的方法分离得到的多糖浓缩液中虫草多糖含量达80%以上，产品回收率达85%以上。

【技术实现步骤摘要】
一种从蛹虫草培养基中提取及连续富集多糖的方法
本专利技术属于医药保健、食品加工
，具体属于一种从蛹虫草培养基中提取及连续富集多糖的方法。
技术介绍
蛹虫草[Cordycepsmilitaris(Fr)Link.]，又名北冬虫夏草、北虫草，属子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、麦角菌科、虫草属真菌。其为虫草属的模式种，分布广泛，为世界各国学者所认识和接受且在人工条件下育成了完整子座而且蛹虫草具有更高含量的虫草多糖和虫草素等有效成分，其独特药理作用已日益引起药学界的高度重视。由于蛹虫草具有以上优点，成为虫草属中药用虫草菌的佼佼者。蛹虫草人工培养技术的成功，为我国开辟了名贵药材产业化生产的又一片天空。目前，国内蛹虫草的人工培养已进入到产业化阶段。虫草多糖作为蛹虫草的主要活性成分之一，是蛹虫草中含量最高的药理活性物质，含量可以达到10％，是一种很有价值的潜在新型药食两用资源。虫草多糖是由甘露糖、虫草素、腺苷、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、岩藻糖等组成的多聚糖。它的抗癌活性和免疫活性引起人们的极大兴趣，另外冬虫夏草还用于治肺结核、气短喘咳、阳痿、梦遗、自汗盗汗、腰膝酸痛等。目前在工业生产中虫草多糖主要从蛹虫草子实体中提取。但是由于虫草子实体的生产成本高，从而导致虫草多糖的生产成本极高。如今蛹虫草的人工栽培技术已经相当成熟，广泛应用于生产，取得了一定的经济效益，随之产生的问题是大量的培养基（下脚料）废弃，发酸变臭，造成环境污染。也有研究者将其作为动物饲料，但没有对其进行综合利用。根据我们前期的测定发现，蛹虫草固体培养基中充满菌丝，其中富含大量的虫草多糖，但因没有成熟的工艺对其中的有效成份进行提取分离，通常在培养结束后固体培养基都被作为废物弃掉。目前用虫草多糖的提取方法主要有热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法、超声波提取法、微波提取法等，上述这些方法由于存在虫草多糖溶出率低、产品杂质多、工艺复杂、生产周期长等缺点，使其工业化生产和大规模临床应用收到限制，而利用淀粉酶、蛋白质和纤维素酶等复合酶处理等绿色提取技术对蛹虫草菌丝体或培养基进行前处理，通过对酶法提取条件进行控制，可最大程度降低其中淀粉、纤维素等对虫草多糖提取的影响，也可最大程度提高虫草多糖的得率和纯度，同时排除淀粉、纤维素等非功能性多糖对产品质量的影响具有提取条件温和、提取率高等优点。而且最新研究表明，虫草等真菌多糖的药理活性与其结构、相对分子量等密切相关，一般分子量在30-250KDa的大分子组分才具有较强的生物活性。然而，传统虫草多糖的提取方法，如水提醇沉法等，得到的粗多糖组成较为复杂，分子量范围广，而且多糖经乙醇作用后，高级结构很容易遭到破坏，很难保证每批次产品的质量和疗效，因此，对具有生物活性的多糖进行有效地提取和富集，对控制虫草多糖产品的质量具有十分重要的意义。
技术实现思路
针对
技术介绍
提出的不足，本专利技术研究一种从蛹虫草培养基中提取及连续富集多糖的方法，其目的在于：本方法利用酶法等绿色提取技术联合功能型膜分离技术制备虫草多糖，即保证了虫草多糖的纯度和品质，又实现了快速富集浓缩，并保证了多糖的生物活性。本专利技术的技术解决方案：一种从蛹虫草培养基中提取及连续富集多糖的方法，包括如下步骤：对蛹虫草大米残余培养基进行干燥、超微粉碎、生物多酶体系酶法水解、离心过滤、回流控制、多功能膜浓缩富集、喷雾干燥、定性定量检测等步骤。干燥步骤具体为：将同一品种采收用蛹虫草后的蛹虫草大米培养基切成片状，在真空干燥箱中70-100℃下分别烘干2-4次，每次1.5-3h，至培养基切片含水量为≤5%。超微粉碎步骤具体为：将已准备的含水量≤5%的蛹虫草大米培养基切片用锤片粉碎机粉碎，过100目筛，得到蛹虫草大米培养基粗粉，进一步将其经超音速气流旋转碰撞式粉碎机粉碎后，颗粒由空气流送至旋风分离器，不同粒度的蛹虫草大米培养基粉经分离后分别进入初级收集器和二级收集器，得到气流粉碎一级分离物和二级分离物（获得量较少），气流粉碎一级分离物。将已经制备好的气流粉碎一级分离物放入行星球磨罐，采用物料和研磨球1:1-1:3的比例进行行星球磨粉碎1-3h，共粉碎2-3次（粉碎时间合计不超过6h），得到粒度均匀的蛹虫草大米培养基超微粉，粒度分布为20-60μm，粉末含量≤3%。生物多酶体系酶法水提步骤具体为：在上述培养基超微粉中加入比例为10-30倍的水后，先在60-100℃下浸提1-4h，然后加入纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶（这三种酶需最适温度和最适pH接近，最适pH范围为6.0-7.5），三种酶的添加量为提取体系重量的0.03%-0.20%（m/v），三种酶的比例为1:1:1。将上述预浸提后的浸提液用HCl或者NaOH调节pH至上述酶的最适范围，并将温度调节至35-45℃，搅拌酶解2-6h后，将pH调节至中性，并于90-95℃下灭酶3-6min，冷却至室温。离心过滤及回流控制步骤具体为：将上述得到的含有沉淀的提取液进行过滤，并将滤液在3000-5000r/min的速度下利用立式自动刮刀下部卸料离心机离心10-30min，得到含有蛹虫草多糖的上清提取液;将得到的沉淀加入比例为5-15倍的水，按照生物多酶体系酶法水提步骤中酶用量、用法再提取1-2次，所得滤液可与上述提取液合并使用。多功能膜浓缩富集步骤具体为：将上述得到的蛹虫草多糖提取液利用陶瓷膜设备进行活性富集。在超滤富集进行之前先使用0.1-0.45μm膜微滤，以除去连续压滤后少量的悬浮固形物和小颗粒物质，料液温度为30-60℃，pH6-8之间，操作压力0.1-0.4MPa，微滤时间0.5-3.5h，收集微滤液待用；将上述得到的微滤液置于多功能超滤设备储液桶中，根据活性多糖分子量分布范围，选取截留分子量（MwCO）为30-300KDa的有机膜超滤，超滤压力选择为0.1-0.4MPa，pH6-8之间，微滤时间0.5-3.0h；得到的截留液再用0.1-0.45μm的微滤膜进行浓缩富集0.5-3.5h，此时所得多糖浓缩液浓缩倍数为5-15倍，且多糖分子量分布处于30-250KDa的活性范围。喷雾干燥步骤具体为：如欲生产干粉型虫草多糖产品，可利用闭式循环喷雾干燥机进行干燥处理，设置喷雾干燥设备入口温度为150-190℃，出口温度为60-100℃，进行调喷雾干燥后即可收集蛹虫草多糖超微粉。定性定量检测步骤具体为：（1）高效液相色谱法测定虫草多糖含量、纯度及分子量将不同分子量的标准Dextran相继进样，记录保留时间（TR），以各标准品的保留时间（TR）为横坐标，其分子量（M）为纵坐标绘制标准曲线，得出分子量与保留时间（TR）的回归方程。高效液相色谱条件为：色谱仪：Agilent1200高效液相色谱仪；色谱柱：TSK-GELG4000PWXL色谱柱（300×7.8mm）；检测器：Alltech3300型蒸发光散射检测器（ELSD），灵敏度为7，雾化温度55℃，雾化压力3.06bar；柱温：30℃；流动相：ddH2O；流速：0.8mL/min；进样量：20μL各虫草多糖样品按上述步骤进样，根据各虫草多糖在色谱图上峰的数目和形状来鉴定多糖的纯度；另外，根据所得的保留时间（TR），通过标准曲线的回归方程计算各多糖的相对分子量；（2）硫酸-苯酚法测定虫草多糖含量标准曲线的制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从蛹虫草培养基中提取及连续富集多糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：蛹虫草发酵残余培养基干燥：将蛹虫草大米培养基切成片状，在真空干燥箱中70‑100℃下分别烘干2‑4次，每次1.5‑3h，制取蛹虫草发酵残余培养基，含水量为≤5%；步骤二：超微粉碎：将步骤一制取的蛹虫草大米培养基切片粉碎，过100目筛，得到蛹虫草大米培养基粗粉，不同粒度的蛹虫草大米培养基粉经分离后分别进入初级收集器和二级收集器，得到气流粉碎一级、二级分离物和气流粉碎一级分离物；将已经制备好的气流粉碎一级分离物放入行星球磨罐，采用物料和研磨球1:1‑1:3的比例进行行星球磨粉碎1‑3h，共粉碎2‑3次（粉碎时间合计不超过6h），得到粒度均匀的蛹虫草大米培养基超微粉，粒度分布为20‑60μm，粉末含量≤3%；步骤三：生物多酶体系酶法水解:将步骤二得到的培养基超微粉中加入比例为10‑30倍的水后，先在60‑100℃下浸提1‑4h，然后加入纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶；将上述预浸提后的浸提液用HCl或者NaOH调节pH至6.0‑7.5，并将温度调节至35‑45℃，搅拌酶解2‑6h后，将pH调节至中性，并于90‑95℃下灭酶3‑6min，冷却至室温；步骤四：离心过滤，回流控制：制取蛹虫草多糖；步骤五：多功能膜浓缩富集：A、将步骤四得到的蛹虫草多糖提取液利用陶瓷膜设备进行活性富集；B、使用0.1‑0.45μm膜微滤，以除去A步骤连续压滤后少量的悬浮固形物和小颗粒物质，料液温度为30‑60℃，pH 6‑8之间，操作压力0.1‑0.4MPa，微滤时间0.5‑3.5h，收集微滤液待用；C、将微滤液置于多功能超滤设备储液桶中，有机膜超滤；D、得到的截留液再用0.1‑0.45μm的微滤膜进行浓缩富集0.5‑3.5h，且多糖分子量分布处于30‑250 KDa的活性范围；步骤六：喷雾干燥：制取集蛹虫草多糖超微粉。...

【技术特征摘要】
1.一种从蛹虫草培养基中提取及连续富集多糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：蛹虫草发酵残余培养基干燥：将蛹虫草大米培养基切成片状，在真空干燥箱中70-100℃下分别烘干2-4次，每次1.5-3h，制取蛹虫草发酵残余培养基，含水量为≤5%；步骤二：超微粉碎：将步骤一制取的蛹虫草大米培养基切片粉碎，过100目筛，得到蛹虫草大米培养基粗粉，不同粒度的蛹虫草大米培养基粉经分离后分别进入初级收集器和二级收集器，得到气流粉碎一级、二级分离物和气流粉碎一级分离物；将已经制备好的气流粉碎一级分离物放入行星球磨罐，采用物料和研磨球1:1-1:3的比例进行行星球磨粉碎1-3h，共粉碎2-3次（粉碎时间合计不超过6h），得到粒度均匀的蛹虫草大米培养基超微粉，粒度分布为20-60μm，粉末含量≤3%；步骤三：生物多酶体系酶法水解:将步骤二得到的培养基超微粉中加入比例为10-30倍的水后，先在60-100℃下浸提1-4h，然后加入纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶；将上述预浸提后的浸提液用HCl或者NaOH调节pH至6.0-7.5，并将温度调节至35-45℃，搅拌酶解2-6h后，将pH调节至中性，并于90-95℃下灭酶3-6min，冷却至室温；步骤四：离心过滤，回流控制：制取蛹虫草多糖；步骤五：多功能膜浓缩富集：A、将步骤四得到的蛹虫草多糖提取液利用陶瓷膜设备进行活性富集；B、使用0.1-0.45μm膜微滤，以除去A步骤连续压滤后少量的悬浮固形物和小颗粒物质，料液温度为30-60℃，pH6-8之间，操作压力0.1-0.4MPa，微滤时间0.5-3.5h，收集微滤液待用；C、将微滤液置于多功能超滤设备储液...

【专利技术属性】
技术研发人员：高兆建，杨杰，李同祥，曹泽虹，李勇，沈彬彬，曹建冬，顾强，
申请(专利权)人：徐州鸿宇农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32