从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶的方法技术

一种从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶的方法，它是将猪胰脏经过绞碎后形成胰糜，后者采用提取液进行提取后经过板框过滤、超滤后，采用离子交换树脂进行吸附，洗脱液用反胶束萃取方法进行正萃取和反萃取步骤，反萃取出来的弹性蛋白酶组分经过超滤脱盐浓缩和冷冻干燥后获得高纯度的弹性蛋白酶产品。本发明专利技术制得的弹性蛋白酶产品生物活性达到１２００ＩＵ／ｍｇ以上，比活超过２２００ＩＵ／ｍｇ.ｐ，产品经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，分子量约２５９００Ｄａ，且电泳为单一带，可以作为医药工业用弹性蛋白酶制剂的原料。本发明专利技术的工艺路线也可以用于从猪胰脏中提取纯化其他种类的蛋白酶及生物活性分子。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种从猪胰脏中提取纯化弹性蛋白酶方法，它包括反胶束萃取体系的建立和纯化弹性蛋白酶的亲和反胶束工艺，其特征是方法步骤如下：　（１）反胶束萃取体系的建立：　建立以琥珀酸二（２－乙基己基）酯磺酸钠、十六烷基三甲溴化铵为表面活性剂，以醇类和辛烷按１∶１－１∶１０体积比混合的有机溶剂为表面活性剂溶剂的反胶束体系，组成的反胶束体系对弹性蛋白酶具有良好的亲和性和选择性，具体操作步骤为：取活性为１００ＩＵ／ｍｇ左右的弹性蛋白酶粗提液１００ｍＬ与一定体积的ＡＯＴ／丁醇／异辛烷或十六烷基三甲基溴化铵／正己醇／正辛烷反胶束溶液搅拌混匀一定时间，达到萃取平衡，使反胶束与弹性蛋白酶充分作用，然后静置分相，取下层水相中样品测定弹性蛋白酶活性和蛋白含量，计算萃取率，对于反萃取步骤：吸取上层有机相与等体积的盐溶液混匀２０分钟后，静置分相，取下层水相，测定弹性蛋白酶活性和蛋白含量，计算反萃取率，以萃取率和反萃取率分别优化反胶束种类、有机溶剂配比、表面活性剂的终浓度、正萃取时间、正萃取的盐离子浓度和ｐＨ、反萃取的盐离子种类、浓度和ｐＨ等参数，建立的适合纯化弹性蛋白酶的反胶束萃取条件为：正萃取步骤中静置分相的时间为５－３０分钟，正萃取盐离子浓度为０．５－３ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值在１－３之间，反萃取剂ｐＨ为５－１０、盐离子浓度为０－０．５ｍｏｌ／Ｌ，反萃取剂最优为ＮａＡｃ、Ｎａ↓［２］ＣＯ↓［３］或ＫＡｃ溶液，此时反胶束溶液对弹性蛋白酶的活性回收率平均达到９０％以上，弹性蛋白酶活性从１００ＩＵ／ｍｇ左右提高到１２００ＩＵ／ｍｇ以上，比活达到２５００ＩＵ／ｍｇ　ｐ以上；　（２）纯化弹性蛋白酶的亲和反胶束工艺：　取新鲜猪胰脏，经过二次绞碎并磨浆之后，在ｐＨ８．０，２５℃，０．０１ｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ↓［２］和搅拌情况下，激活２－５小时，形成胰糜，胰糜经过８倍体积０．１ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ４．５ＨＡｃ醋酸提取３小时之后，进行板框过滤，滤液用５０－１００ｋＤ和１０ｋＤ超滤膜过滤后得到弹性蛋白酶粗提液，弹性蛋白酶粗提液采用强酸性阳离子交换树脂对目的产物进一步浓缩和富集，同时为后续的反胶束萃取体系做准备，弹性蛋白酶粗提液中加入适量再生好的吸附剂，４℃搅拌吸附２－４小时，过滤，得到的吸附物装柱，用ｐＨ４．０，０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠缓冲液洗涤４－５柱床，再用ｐＨ４．０，的醋酸－醋酸钠溶液洗脱１．５柱床，收集洗脱液，洗脱液直接用（１）中优化的反胶束萃取体系进行正萃取和反萃取操...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨华英，王启要，刘志勇，万偲，李菊根，
申请(专利权)人：南昌市浩然生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]