一种支原体蛋白及其在疫苗中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种防肺炎支原体蛋白疫苗及其规模制备方法，其特征在于：基因序列为SEQ ID NO：1，蛋白序列为SEQ ID NO：2。本发明专利技术通过表达的肺炎支原体P65蛋白，并将蛋白免疫小鼠发现了其较好的抗原性，扩宽了此种蛋白在肺炎支原体检测和疫苗等应用上的研究，为新研制亚单位蛋白疫苗提供很好的抗原物。同时对可溶性蛋白疫苗的表达和纯化步骤进行优化，建立了一种新型防肺炎支原体蛋白疫苗的规模化制备方法，该方法适用于大规模制备人用防肺炎支原体疫苗，安全高效，具有良好的开发和应用前景。为肺炎支原体疫苗的研发奠定基础。

A Mycoplasma protein and its application in vaccine

The invention discloses an anti Mycoplasma protein vaccine and its scale preparation method, which is characterized in that the gene sequence of SEQ ID NO:1 protein sequence was SEQ ID NO:2. Through the expression of Mycoplasma pneumoniae P65 protein and protein immunization in mice, the present invention has good antigenicity and broadens its application in the detection of Mycoplasma pneumoniae and vaccine, and provides a good antigenic for the newly developed subunit protein vaccine. At the same time on the expression of soluble protein vaccine and purification steps were optimized, established a new anti Mycoplasma protein vaccine scale preparation method, this method is suitable for large-scale preparation of human anti mycoplasma pneumonia vaccine, safe and efficient, has good development and application prospect. It lays the foundation for the research and development of Mycoplasma pneumoniae vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种支原体蛋白及其在疫苗中的应用
本专利技术涉及医药生物
，特别涉及一种预防肺炎支原体的蛋白疫苗及其制备方法。
技术介绍
近年来，急性呼吸道感染的死亡率已仅次于心血管疾病，位居第2位，其中下呼吸道感染，是世界范围内导致儿童和老年人高发病率和高死亡率的主要因素，全球每年因肺炎死亡的儿童约190万～220万(陆兰翠.小儿肺炎支原体感染治疗的研究进展[J].中文科技期刊数据库(文摘版)医药卫生，2015，(4)：268-269)。肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)肺炎占社区获得性肺炎的5％～40％，且主要引起青少年感染。但随着大环内酯类药物在临床的广泛应用，已有越来越多耐药菌株产生，且有不断增多的趋势(SAKAIT，ISHIDAT，ARITAM，etal.AstudyontheclinicalcourseandantimicrobialsusceptibilityofMycoplasmapneumoniaeinacommunityhospital[J].KansenshogakuZasshi，2015，89(4)：458-464)。因此，研发肺炎支原体疫苗对预防和控制肺炎有很重要的作用。目前MP的灭活苗的预防效果仅有36％，(LINCHEVSKII，KLEMENTE，NIR-PAZR.Mycoplasmapneumoniaevaccineprotectiveefficacyandadversereactions-systematicreviewandmeta-analysis[J].Vaccine，2009，27(18)：2437-2446)。由于毒苗存在残留的毒力和致病性因素尚未在人体上使用，因此，目前主要研发的方向是亚单位疫苗。由于MP引起细胞损伤的第一步是黏附于宿主细胞表面，因此其疫苗研究的重点就在于抑制病原体的黏附。与MP黏附相关的蛋白挖掘很少，目前主要集中在P1和P30这两个黏附蛋白上，但是都未收到较好的免疫效果。HasselbringBM发现P65蛋白与P30蛋白在黏附复合体形成的过程中几乎同时移动，在由于转座子插入而使P65蛋白受损的突变株中，P30的稳定性下降。将野生株的P65等位基因转座融合入突变株后，P65水平和P30的稳定性都得到了恢复。根据生物结构信息学预测，P65是一种跨膜蛋白，能够与P1和P30有效的结合，有利于肺炎支原体在机体内的运动，缺失了P65的肺炎链球菌感染致病能力明显下降。(HasselbringBM,SheppardES,KrauseDC.P65truncationimpactsP30dynamicsduringMycoplasmapneumoniaegliding[J].JBacteriol,2012,194(11):3000-3007)。因此，本专利技术选择P65蛋白并发现了其免疫原性，对研发肺炎支原体亚单位疫苗提供具有较好的基础。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种防肺炎支原体的蛋白，其核苷酸序列为SEQIDNO：1，氨基酸序列为SEQIDNO：2。本专利技术的另一个目的是提供以上防肺炎支原体蛋白的制备方法，其主要包含步骤：1)肺炎支原体P65基因的合成本专利技术选取的P65基因序列是通过生工生物工程有限公司优化密码子后合成。合成的P65基因连接在PUC19载体上得到PUC19-P65。2)将所述P65片段构建到含有6-His组氨酸标签的表达载体上，得到重组质粒，转化至表达菌，酶切鉴定；3)诱导表达可溶性的重组蛋白；4)纯化步骤3获得的重组蛋白。本专利技术的有益效果：1、本专利技术通过表达的肺炎支原体蛋白，并将蛋白免疫小鼠发现了其较好的抗原性，扩宽了此种蛋白在肺炎支原体检测和疫苗等应用上的研究，为新研制亚单位蛋白疫苗提供很好的抗原物。2、本专利技术同时对可溶性蛋白疫苗的表达和纯化步骤进行优化，建立了一种新型防肺炎支原体蛋白疫苗的规模化制备方法，该方法适用于大规模制备人用防肺炎支原体蛋白疫苗，安全高效，具有良好的开发和应用前景。附图说明图1：是本专利技术中重组质粒pET30a-P65的构建示意图；图2：是本专利技术中pET30a-P65质粒的NcoI和XhoI双酶切质粒，图中M为DNAmarker，1、为载体pET30a；2、为pET30a-P65经NcoI和XhoI双酶切；图3：是本专利技术中经过优化的重组质粒pET30a-P65原核表达和纯化胶图。图中标记说明：M：蛋白分子量；1：pET30a-P65(BL21)未诱导；2：pET30a-P6537℃IPTG诱导5h；3：pET30a-P65纯化；图4：利用本专利技术制备的P65蛋白以及对磷酸盐缓冲液(PBS)免疫BALB/c小鼠后血清中的抗体水平的检测。具体实施方式实施例1：1.pET30a-P65融合基因的构建P65序列由以肺炎支原体M129菌株为序列模板由生工生物工程有限公司合成于PUC19-P65载体上，NcoI和XhoI酶切，并连接于pET30a载体上。PUC19-P65酶切体系如下表：pET30a载体酶切体系如下表：PUC19-P65酶切体系和pET30a载体酶切体系于37℃反应2h,通过1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，纯化回收目的片段。把载体和目的片段用T4连接酶连接，其反应体系如下表：载体1μL(50ng)目的片段1μL(100ng)连接缓冲液1μLT4连接酶0.5μL双蒸水6.5μL获得重组质粒pET30a-P65，其酶切鉴定如图2所示。实施案例2：重组质粒pET30a-P65的原核表达将表达质粒pET30a-P65(卡那抗性)转化大肠杆菌BL21感受态细胞。具体操作如下：1)取50μL大肠杆菌BL21感受态细胞悬液转移到无菌的1.5mlEP管中，加入1μL连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。2)42℃水浴锅内热激90s(让质粒进入感受态细胞)。3)取出冰上放置5min(让感受态细胞关闭)。4)每管加200μLLB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育60min，使细菌复苏。为达到有效转化，转速为200r/min。5)取100μL转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB琼脂平皿上，用无菌弯头玻棒将转化的细胞均匀地涂布到琼脂平板表面。6)将平皿置37℃培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培养，12～16h可出现菌落。原核表达挑取单菌落扩大培养，使用质粒小量提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取其质粒进行酶切鉴定并保存菌液。鉴定正确后，将保存的菌液按照1：1000的体积比进行复苏。次日，按照1：100的体积比进行诱导。在终浓度为0.8mMIPTG、37℃和180r/min的条件下进行诱导。分别在诱导前和诱导后3h、4h、5h和6h取样2mL，并以转化pET-30a载体的E.coliBL21(DE3)的细菌诱导产物作为空白对照。12000r/min离心1min后，加入100μLddH2O重悬菌液后，加入25μL5×LoadingBuffer，在100℃的沸水中煮沸10min，冰浴10min后，通过12％SDS-PAGE进行样品分析，确定重组的原核蛋白是否表达。在进行SDS-PAGE检测时，上样前，将所有的样品10000r/min离心1min，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防肺炎支原体的蛋白，其特征在于：其核苷酸序列为 SEQ ID NO ：1，氨基酸序列为SEQ ID NO ：2 。

【技术特征摘要】
1.一种防肺炎支原体的蛋白，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO：1，氨基酸序列为SEQIDNO：2。2.如权利要求1所述的防肺炎支原体蛋白的制备方法，其特征在于：1)肺炎支原体P65基因的合成人工合成的P65基因连接在PUC19载体上...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小东，
申请(专利权)人：重庆斯德姆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50