茚达特罗在治疗结直肠癌中的应用制造技术

本申请为茚达特罗在治疗结直肠癌中的应用，属于分子生物学领域，具体的为肿瘤治疗，具体为从选现有技术中已经公开的药物中筛选获得茚达特罗具有治疗结直肠肿瘤的效果，通过细胞学实验和动物实验证明，茚达特罗可以抑制结直肠肿瘤细胞系的增殖、侵袭、迁移；能够在小鼠模型中显著降低肿瘤病灶的大小；同时，本申请还首次发现了茚达特罗是通过矫正肿瘤细胞中的可变剪接实现上述效果的。

The application of Indatero in the treatment of colorectal cancer

The application for Indatero in the application in the treatment of rectal cancer, belongs to the field of molecular biology, specifically for tumor therapy, specifically for drug screening from selected indacaterol obtained in the prior art has been open with the treatment of colorectal cancer, through cytological experiments and animal experiments show that indacaterol can inhibit the proliferation of colorectal cancer cell lines invasion and migration; can significantly reduce the tumor size in the mouse model; at the same time, the application is also found for the first time Indatero is through the correction of alternative splicing in tumor cells to achieve the above effect.

【技术实现步骤摘要】
茚达特罗在治疗结直肠癌中的应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体为肿瘤治疗领域，涉及一系列根据结直肠癌特异性表达的标志物筛选获得的治疗药物。具体的，本专利技术首次利用基因可变剪切筛选治疗结直肠癌的药物，具体的，所述的药物为茚达特罗(Indacaterol)。
技术介绍
结直肠癌是当今世界对人类生存和健康构成极大威胁的恶性肿瘤之一，列西方发达国家癌症死亡谱的第三位。在我国，随着居民生活方式和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率上升趋势明显，以每年4％的速度递增，年均增长速度高出世界范围2个百分点。人类基因组计划发现，人体大概有23,000个基因，远远少于转录出来的蛋白质种类。其中，可变剪切对蛋白质组的多样性发挥着重要的作用。可变剪切通过对前体RNA进行剪切重连得到不同的mRNA从而被翻译成不同的蛋白质构体。异常的可变剪切与肿瘤的发生、神经以及肌肉相关疾病、心血管疾病均存在着重要的关联。在肿瘤的发生与发展过程中普遍存在着异常的剪切。大部分肿瘤相关基因由于异常剪切而产生异常的生理学功能。异常剪切的肿瘤标志物在凋亡，增值，免疫逃避，血管生成，侵袭迁移等肿瘤病理学中均发挥着重要的功能。例如抗血管生长因子VEGF165b与促血管生成作用的VEGF165是由同一转录本经可变剪切产生的。通过可变剪切，VEGF165b较VEGF165在外显子8上少了5’一小段氨基酸序列。VEGF165能够以同样的亲和力结合血管内皮生长因子受体VEGFR2，竞争性拮抗VEGF165的促血管生成作用。在结直肠癌组织样本中，剪切体(VEGF)165b在mRNA水平异常下调，而VEGF165含量增加。因此可以确定，可变剪切的紊乱在肿瘤生物学过程中发挥着重要的作用。相较于正常细胞，肿瘤细胞在可变剪切模型上存在着巨大的差异，部分基因的剪切体甚至是存在着有和无的差异。调控肿瘤细胞中的异常剪切事件为精准医疗提供了一个很好的切入点。茚达特罗(Indacaterol)，商品名马来酸茚达特罗吸入粉雾剂，是一种化学品。化学名称(R)-5-[2-(5,6-二乙基二氢茚-2-基氨基)-1-羟乙基]-8-羟基-1H-喹啉-2-酮，分子式为C24H28N2O3，分子量为392.49100。茚达特罗为平喘药(支气管扩张剂)，临床上主要适用于成人慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisorder,COPD)患者的维持治疗。目前关于茚达特罗在治疗COPD的作用机理有进一步的研究，即茚达特罗作为β2肾上腺素受体2(ADRB2)的激动剂，促进了β-arrestin-2介导的ADRB2的细胞内陷。但是，茚达特罗是否能够通过调控可变剪切来治疗癌症，达到降低癌症病灶的效果现有技术中并未提及，且未有动物实验证明其治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的一个方面是将结直肠癌肿瘤的异常剪切基因作为筛选用于治疗结直肠癌药物的作用靶点，具体的，针对ECM1，USMG5，PPIL2，EEF1D,CBDW3，ZO‐1六个异常剪切基因，从上市的治疗药物中进行筛选能调控其剪切的药物；更进一步的，所述的药物为化学药物。在本专利技术的一个具体实施例中，发现了用于成人慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的药物茚达特罗可以应用于肿瘤的治疗，在一个具体的实施例中，所述的肿瘤为结直肠癌；在另外一个具体的实施例中，茚达特罗是通过调控细胞中的可变剪接，从而达到抑制细胞增殖、迁移、侵袭的效果。有益效果：本专利技术首次通过针对可变剪切事件筛选出可以治疗结直肠癌的有效药物茚达特罗；另外，本申请还首次披露了茚达特罗治疗结直肠肿瘤过程中可能参与的信号通路，具体的，通过抑制细胞的可变剪接，实现对于肿瘤细胞的抑制。附图说明图1茚达特罗对SW620具有细胞毒性，且具有剂量依赖性，其IC50值为19.01μM(图1a)，抑制细胞增殖(图1b)，抑制细胞的侵袭和迁移(图1c)。图2对SW620细胞系施用茚达特罗，分别检测ECM1，USMG5，PPIL2，EEF1D,CBDW3，ZO‐1的表达情况，以DMSO为对照，施用茚达特罗使得上述的6个基因mRNA剪切变化。图3为C57小鼠AOM/DSS结直肠癌模型中，施用茚达特罗可以减少肿瘤灶个数，在0.5mg/kg以及2.5mg/kg浓度下，可以完全消除肿瘤灶。具体实施方式实验方法：1、材料：结直肠癌细胞系SW620由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供；RPMI1640、DMEM、0.05％Trypsin，购于博士德公司；胎牛血清购于四季青公司。氧化偶氮甲烷购于sigma公司(批号098k1488)，葡聚糖硫酸钠MPBiomedicals(批号0216011050)茚达特罗购买自Selleck公司(批号S3083)；其他药品为国产分析纯。2、细胞培养：结直肠癌细胞系贴壁生长于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃，5％CO2湿化培养箱中培养，隔天传代一次。3、细胞迁移、侵袭实验：2μg/ml的纤维连接蛋白(Fn)均匀涂在Transwell小室(CostarCorp.,Cambridge,MA)滤膜背面，晾干。使用胰酶消化处于对数生长期的细胞，3000g转速离心，使用无血清培养基重悬细胞沉淀。计数细胞悬液，取1×105个/孔接种于Transwell小室内，Transwell小室下层加600μl含10％胎牛血清的培养液，上层加100μl无血清培养基，37℃，5％CO2孵箱内培养。培养48h‐72h后取出Transwell，吸弃Transwell孔内培养基，PBS清洗2次，使用棉签擦净膜上层，加入4％多聚甲醛固定细胞20min，PBS洗3次，0.1％结晶紫染色15min，PBS洗3次，倒置显微镜观察拍照。拍照后将Transwell置于33％冰醋酸浸泡，洗脱Transwell下层染上的结晶紫，酶标仪采用450nm处进行分光光度检测。细胞侵袭试验：Matrigel(BDBiosciences,Bedford,MA)置于4℃预置过夜。2μg/ml的纤维连接蛋白(Fn)均匀涂在Transwell小室(CostarCorp.,Cambridge,MA)滤膜背面，晾干。使用预冷的无血清培养基以1:5的比例稀释4℃过夜的matrigel，取50μl稀释后的matrigel加入Transwell小室内，37℃静置30min进行包被。使用胰酶消化处理对数生长期的细胞，3000g转速离心，使用无血清培养基重悬细胞沉淀。计数细胞悬液，取1×105个/孔接种于Transwell小室内，Transwell小室下层加600μl含10％胎牛血清的培养液，上层加100μl无血清培养基，37℃5％CO2孵箱内培养。培养48h‐72h后取出Transwell小室，吸弃孔内培养基，PBS洗2次，使用棉签擦净膜上层，加入4％多聚甲醛固定细胞20min，PBS洗3次，0.1％结晶紫染色15min，PBS洗3次，倒置显微镜观察拍照。拍照后将Transwell置于33％冰醋酸浸泡，洗脱Transwell下层染上的结晶紫，酶标仪采用450nm处进行分光光度检测。4、CCK‐8细胞增殖实验：细胞增殖实验采用博士德细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK‐8)：(1)取对数生长期的细胞，以2000个/孔，接种于96本文档来自技高网...

【技术保护点】
茚达特罗在制备治疗肿瘤药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.茚达特罗在制备治疗肿瘤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，所述的肿瘤为结直肠肿瘤。3.根据权利要求1或2所述的应用，所述的茚达特罗在治疗结直肠肿瘤中，通过调节...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红河，万乐栋，来茂德，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33