一种猪旋毛虫病疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪旋毛虫病疫苗及其制备方法和应用。首先扩增

A swine trichinellosis vaccine and preparation method and application thereof

The invention discloses a pig trichinellosis vaccine and preparation method and application thereof. First amplification

【技术实现步骤摘要】
一种猪旋毛虫病疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种猪旋毛虫病疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
旋毛虫（Trichinellaspiralis）是一种人畜共患的寄生性线虫，可寄生于包括人、猪、犬、鼠、猫等150多种哺乳动物，引起旋毛虫病。猪和鼠的相互感染是人类旋毛虫病流行的重要来源，其中猪为主要的动物传染源。生食或半生食受染旋毛虫幼虫囊包的猪肉是人群感染旋毛虫的主要方式。旋毛虫病呈世界性分布，主要表现为发热、水肿等症状，继而出现肌肉疼痛、四肢乏力等症状，严重者可导致死亡。近年来，世界许多地区均出现了该病的流行与爆发。在我国，云南、河南、广西、西藏和四川等地均出现过居民由于食入生的或未煮熟的猪肉和狗肉而发病发生死亡的案例。在畜牧业中，猪旋毛虫病是肉类食品安全性的一个重要问题，给养猪业和肉类贸易造成巨大的经济损失。迄今为止，旋毛虫病尚无快速有效的诊断方法。因此研制疫苗，是预防该疾病发生发展的重要策略。在旋毛虫疫苗技术研究方面，针对旋毛虫病的各类疫苗都处于起步研究阶段，如减毒活疫苗、天然抗原疫苗、合成肽疫苗、重组抗原疫苗、核酸疫苗等多种类型。然而，目前尚无有效的旋毛虫疫苗。在旋毛虫的整个生活周期中，抗原在宿主环境和宿主免疫应答中起着重要的作用。根据旋毛虫解剖部位将其分为表面抗原、排泄-分泌（ES）抗原、虫体抗原和杆细胞颗粒相关抗原。由于旋毛虫虫体粗抗原及表面抗原成分复杂，且旋毛虫不能通过体外培养完成整个生活史，难以通过人工感染动物标准化批量生产的方法制备此类抗原，无法满足免疫诊断及免疫预防用抗原的需要。ES抗由发育成熟的幼虫杆状体分泌，直接暴露于宿主的免疫系统且具有较好的特异性，是诱导宿主产生免疫应答反应的主要靶抗原，也是重要的疫苗候选分子。由于旋毛虫目前仍无法在体外进行传代培养，所获得的ES抗原难以保证其稳定性，并且ES抗原是多种抗原的混合物，难以区分有效抗原成分或纯化处理。随着基因工程技术日趋成熟和多样化发展，基因重组抗原具有可大量制备、特异性好等优点而越来越受到人们的重视。因此重组ES抗原成为旋毛虫病免疫学防治的焦点。研究发现旋毛虫肌幼虫ES产物的培养液具有免疫原性。近年来蛋白质组学分析及质谱分析均发现旋毛虫肌幼虫ES蛋白中含有一定量的半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶（cathepsin）B、H、L、X等。研究报道肠道线虫、肠道蠕虫的半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的肠道入侵、移行、生殖发育、营养摄取、肌内成囊，以及免疫入侵等过程中发挥重要作用，是抗寄生虫疫苗的重要候选分子。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，通过3’RACE-PCR技术扩增得到了一个全新的的旋毛虫组织蛋白酶B基因TsCPB2，应用旋毛虫TsCPB2基因构建的重组抗原具有良好的免疫原性，可用于制备预防旋毛虫感染的疫苗，制备得到的疫苗具有良好的免疫保护效果，可用于预防治疗猪旋毛虫病。本专利技术的目的是提供一种旋毛虫病疫苗。本专利技术的另一目的是提供所述旋毛虫病疫苗的制备方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：本专利技术以TsCPB2EST序列（AccessionNo.EX501780）设计基因特异性扩增引物，利用3’RACE-PCR技术扩增得到了一个全新的的旋毛虫组织蛋白酶B基因TsCPB2，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQID：2所示。优选地，所述特异性扩增引物序列如下所示：TsCPB2-5’GSPouterprimer：5’-CGGATCTGTTGTCCTGGTTGG-3’（SEQID：4）TsCPB2-5’GSPinnerprimer：5’-CTGTTGTCCTGGTTGGATAAA-3’（SEQIDNO：5）首先，本专利技术提供TsCPB2基因及其编码氨基酸如下所述的应用：SEQIDNO：1所示旋毛虫组织蛋白酶B基因TsCPB2在制备旋毛虫排泄-分泌抗原中的应用。SEQIDNO：2所示旋毛虫组织蛋白酶B2在制备制备旋毛虫排泄-分泌抗原中的应用。SEQIDNO：1所示旋毛虫组织蛋白酶B基因TsCPB2在制备旋毛虫病疫苗中的应用。SEQIDNO：2所示旋毛虫组织蛋白酶B2在制备旋毛虫病疫苗中的应用。优选地，是在制备猪旋毛虫病疫苗中的应用。一种旋毛虫排泄-分泌抗原的制备方法，所述方法为扩增TsCPB2基因的成熟区并克隆至His标签的表达载体中，转化大肠杆菌，诱导表达后，Ni-亲和层析纯化TsCPB2重组蛋白，得到旋毛虫排泄-分泌抗原；所述TsCPB2基因的序列如SEQIDNO：1所示，其成熟区序列如SEQIDNO：3所示。优选地，所述表达载体为pET30a（+）。优选地，所述诱导表达为在终浓度为1mM的IPTG诱导剂中，37℃诱导培养4h。优选地，诱导表达后离心收集菌体，将菌体重悬后，冻融，加入溶菌酶裂解，再超声破碎，离心得到包涵体蛋白。所述包涵体蛋白需用去污剂和低浓度的变性剂洗涤，除去脂类和膜蛋白，再溶解得到可溶性蛋白。优选地，所述去垢剂为TritonX-100，所述变性剂为尿素。更优选地，将包涵体蛋白用下列溶液各洗涤一次：a.50mMTris/HCl,500mMNaCl，pH8.0含有1%TritonX-100（200ml/500ml菌液）；b.50mMTris/HCl,500mMNaCl，pH8.0含有4M尿素（100ml/500ml菌液）；c.50mMTris/HCl,500mMNaCl，pH8.0含有2M尿素（100ml/500ml菌液）；然后4℃，6000g离心15min；再将沉淀中的包涵体蛋白溶解在以下溶液：50mMTris/HCl,pH7.9、500mMNaCl、6M尿素，室温剧烈摇匀过夜，使得包涵体蛋白完全溶解。优选地，所述Ni-亲和层析纯化为将蛋白样品轻轻加入Ni柱，控制流速在5ml/h，收集流出液；10倍体积1×BindingBuffer（含6M尿素）过柱，再20倍体积WashBuffer（含6M尿素）漂洗杂蛋白；最后用含有咪唑的Elutebuffer（含6M尿素）含洗脱目的蛋白。同时，上述任一方法制备得到的旋毛虫排泄-分泌（ES）抗原亦在本专利技术保护范围内。另外，所述旋毛虫排泄-分泌（ES）抗原在制备旋毛虫病疫苗或旋毛虫病抗体中的应用亦在本专利技术保护范围内。一种旋毛虫病疫苗，是将所述旋毛虫排泄-分泌（ES）抗原即TsCPB2重组蛋白与免疫佐剂混合乳化，得到TsCPB2重组抗原疫苗。优选地，所述免疫乳化佐剂为弗氏佐剂。更优选地，首次免疫采用弗氏完全佐剂，二免、三免采用弗氏不完全佐剂。另外，本专利技术制备得到的旋毛虫病疫苗在防控猪旋毛虫病中的应用亦在本专利技术保护范围内。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：（1）本专利技术制备得到了一种旋毛虫重组ES抗原，所述重组抗原具有良好的免疫原性，可用于制备防控旋毛虫病的疫苗。（2）本专利技术制备得到了一种旋毛虫病疫苗，该疫苗免疫小鼠或猪，能诱导宿主产生免疫反应，并对旋毛虫感染起到良好的免疫保护作用，具有较大的应用前景。附图说明图1为本专利技术TsCPB2基因的全长核苷酸序列和推导的氨基酸序列；其中，TsCPB2的成熟区用阴影表示。图2为TsCPB2重组蛋白的表达与纯化SDS-PAGE分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
SEQ ID NO：1所示旋毛虫组织蛋白酶B基因

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO：1所示旋毛虫组织蛋白酶B基因TsCPB2在制备旋毛虫排泄-分泌抗原中的应用。2.SEQIDNO：2所示旋毛虫组织蛋白酶B2在制备旋毛虫排泄-分泌抗原中的应用。3.SEQIDNO：1所示旋毛虫组织蛋白酶B基因TsCPB2在制备旋毛虫病疫苗中的应用。4.SEQIDNO：2所示旋毛虫组织蛋白酶B2在制备旋毛虫病疫苗中的应用。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，是在制备猪旋毛虫病疫苗中的应用。6.一种旋毛虫排泄-分泌抗原的制备方法，其特征在于，扩增TsCPB2基因的成熟区并克隆至His标签的表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖婉琴，周兴旺，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44