一种禽白血病病毒分离用的DF‑1细胞培养方法技术

本发明专利技术所述一种禽白血病病毒分离用的DF‑1细胞培养方法，包括以下步骤：1)将收集的抗凝血1500rpm离心10min，吸取上清与沉淀交界处的白色绒毛状淋巴细胞至1.5mL离心管中，形成血浆样品；2)将DF‑1细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔中有细胞培养液；3)每孔分别加入分离好的血浆样品以及阴阳性对照；4)将细胞培养板放至细胞培养箱中培养24小时，然后将细胞培养液换为细胞维持液继续培养；5)9天后，将细胞在‑80℃和室温下反复冻融2‑3次；6)最后一次冻融后，收集培养物，使用ELISA方法检测p27抗原；采用该方法，DF‑1细胞培养快速，细胞培养质量好。

Avian leukemia virus isolated by DF 1 cell culture method

The invention of the avian leukemia virus isolation with DF 1 cell culture method, which comprises the following steps: 1) the anticoagulant 1500rpm centrifugal 10min collection, the supernatant and precipitation from the junction of white villous lymphocytes to 1.5mL centrifuge tube, the formation of plasma samples; 2) DF 1 cell suspension into cell culture plate with 96 holes, each hole in the cell culture medium; 3) per hole were added to a good separation of plasma samples and positive and negative control; 4) the cell culture plate to cell culture medium for 24 hours, and then the cell culture medium for cell maintenance to liquid culture; 5) 9 days later, the cells in at room temperature of 80 DEG C and 2 freeze-thaw 3 times; 6) the last time after freezing and thawing, collecting culture, use the ELISA method to detect p27 antigen; using this method, DF 1 rapid cell culture, cell culture and good quality.

【技术实现步骤摘要】
一种禽白血病病毒分离用的DF-1细胞培养方法
本专利技术涉及一种细胞培养方法，具体地说，涉及一种禽白血病病毒分离用的DF-1细胞培养方法。
技术介绍
禽白血病是由禽C型反录病毒群的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，主要是淋巴细胞性白血病，其次是成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病。此外还可引起骨髓细胞瘤、结缔组织瘤、上皮肿瘤、内皮肿瘤等。大多数肿瘤侵害造血系统，少数侵害其他组织。本病在自然情况下只有鸡能感染。Rous肉瘤病毒宿主范围最广，人工接种在野鸡、珍珠鸡、鸽、鹌鹑、火鸡和鹧鸪也可引起肿瘤。不同品种或品系的鸡对病毒感染和肿瘤发生的抵抗力差异很大。母鸡的易感性比公鸡高，多发生在18周龄以上的鸡，呈慢性经过，病死率为5％～6％。DF-1细胞是一种稳定的、无肿瘤基因的、可传代的鸡胚成纤维细胞系，细胞形态呈纤维状，该细胞缺少禽白血病病毒，肉瘤病毒内源性基因，被广泛用于动物病毒研究、疫苗研制及癌症研究等诸多领域。但是，现有的DF-1细胞培养效率低，而且细胞培养质量差。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术中的缺点，提供了一种禽白血病病毒分离用的DF-1细胞培养方法，极大的提升了工作效率，培养速度快，质量好。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种禽白血病病毒分离用的DF-1细胞培养方法，包括以下步骤：1)将收集的抗凝血1500rpm离心10min，吸取上清与沉淀交界处的白色绒毛状淋巴细胞至1.5mL离心管中，形成血浆样品；2)将DF-1细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔中有细胞培养液；3)每孔分别加入分离好的血浆样品以及阴阳性对照；4)将细胞培养板放至细胞培养箱中培养24小时，然后将细胞培养液换为细胞维持液继续培养；5)9天后，将细胞在-80℃和室温下反复冻融2-3次；6)最后一次冻融后，收集培养物，使用ELISA方法检测p27抗原。进一步，所述细胞培养液包括FBS10％和dmem/f-12培养基90％。进一步，所述细胞维持液包括FBS1％和dmem/f-12培养基99％。进一步，步骤1)中所述抗凝血中加入其质量1％的Pen-Strep。进一步，步骤4)中所述DF-1细胞培养时，通过0.25％Trypsin-EDTA进行细胞的消化，通过PBS清洗。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术所述一种禽白血病病毒分离用的DF-1细胞培养方法，包括以下步骤：1)将收集的抗凝血1500rpm离心10min，吸取上清与沉淀交界处的白色绒毛状淋巴细胞至1.5mL离心管中，形成血浆样品；2)将DF-1细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔中有细胞培养液；3)每孔分别加入分离好的血浆样品以及阴阳性对照；4)将细胞培养板放至细胞培养箱中培养24小时，然后将细胞培养液换为细胞维持液继续培养；5)9天后，将细胞在-80℃和室温下反复冻融2-3次；6)最后一次冻融后，收集培养物，使用ELISA方法检测p27抗原；采用该方法，DF-1细胞培养快速，细胞培养质量好。具体实施方式以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术所述一种禽白血病病毒分离用的DF-1细胞培养方法，包括以下步骤：1)将收集的抗凝血1500rpm离心10min，吸取上清与沉淀交界处的白色绒毛状淋巴细胞至1.5mL离心管中，形成血浆样品；2)将DF-1细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔中有细胞培养液，细胞培养液包括FBS10％和dmem/f-12培养基90％，FBS为胎牛血清；3)每孔分别加入分离好的血浆样品以及阴阳性对照；4)将细胞培养板放至细胞培养箱中培养24小时，DF-1细胞培养时，通过0.25％Trypsin-EDTA进行细胞的消化，Trypsin-EDTA为胰蛋白酶，通过PBS清洗，PBS是磷酸缓冲盐溶液，FBS为胎牛血清，然后将细胞培养液换为细胞维持液继续培养，细胞维持液包括FBS1％和dmem/f-12培养基99％；5)9天后，将细胞在-80℃和室温下反复冻融2-3次；6)最后一次冻融后，收集培养物，使用ELISA方法检测p27抗原。进一步，步骤1)中所述抗凝血中加入其质量1％的Pen-Strep，Pen-Strep为双抗。最后应说明的是：以上仅为本专利技术的优选实施例而已，并不用于限制本专利技术，尽管参照实施例对本专利技术进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽白血病病毒分离用的DF‑1细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将收集的抗凝血1500rpm离心10min，吸取上清与沉淀交界处的白色绒毛状淋巴细胞至1.5mL离心管中，形成血浆样品；2)将DF‑1细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔中有细胞培养液；3)每孔分别加入分离好的血浆样品以及阴阳性对照；4)将细胞培养板放至细胞培养箱中培养24小时，然后将细胞培养液换为细胞维持液继续培养；5)9天后，将细胞在‑80℃和室温下反复冻融2‑3次；6)最后一次冻融后，收集培养物，使用ELISA方法检测p27抗原。

【技术特征摘要】
1.一种禽白血病病毒分离用的DF-1细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将收集的抗凝血1500rpm离心10min，吸取上清与沉淀交界处的白色绒毛状淋巴细胞至1.5mL离心管中，形成血浆样品；2)将DF-1细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔中有细胞培养液；3)每孔分别加入分离好的血浆样品以及阴阳性对照；4)将细胞培养板放至细胞培养箱中培养24小时，然后将细胞培养液换为细胞维持液继续培养；5)9天后，将细胞在-80℃和室温下反复冻融2-3次；6)最后一次冻融后，收集培养物，使用ELISA方法检测p27抗原。2.根据权利要求1所述一种禽白血病病毒分离用...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘大伟，郭露铰，冯甫荣，张玉龙，
申请(专利权)人：佛山市高明区新广农牧有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44