一种壳聚糖纳米颗粒CS‑IL‑17RC及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种壳聚糖蛋白纳米颗粒，其包括IL‑17RC蛋白和壳聚糖纳米颗粒载体，其中IL‑17RC蛋白由mIL‑17RC编码区胞外段去除信号肽部分的基因序列编码，IL‑17RC蛋白通过重组质粒pET28a‑IL‑17RC进行诱导表达蛋白制备；本发明专利技术还涉及一种壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：制备预定浓度的IL‑17RC蛋白；配制壳聚糖溶液；制备壳聚糖蛋白纳米颗粒(CS‑IL‑17RC)。本发明专利技术制备的壳聚糖纳米颗粒，选用有机纳米颗粒壳聚糖，包裹IL‑17RC蛋白，对组合的蛋白形成保护作用，且具有良好的粘膜粘附作用，通过鼻腔粘膜吸收，可达到良好的免疫效果。通过体外体内实验证实壳聚糖纳米颗粒能够与IL‑17特异性结合，抑制其功能，从而调控哮喘病理过程，减轻哮喘气道炎症反应，使临床症状得到缓解。

A kind of chitosan CS nanoparticles IL 17RC and preparation method thereof

The invention relates to a protein chitosan nanoparticles, including IL 17RC protein and chitosan nanoparticles, which IL 17RC protein by mIL 17RC encoding ectodomain removal encoding signal peptide gene sequence, IL 17RC protein was induced to express protein prepared by recombinant plasmid pET28a IL 17RC; the invention also relates to a preparation method of a protein chitosan nanoparticles, which comprises the following steps: preparing a predetermined concentration of IL 17RC protein; preparation of chitosan; preparation of chitosan nanoparticles (CS protein IL 17RC). Chitosan nanoparticles prepared by the invention, the selection of organic nanoparticles chitosan coated IL 17RC protein, form a protective effect on the combination of the protein, and has good effects on mucosal adhesion, absorbed through the nasal mucosa, can reach good immune effects. In vitro and in vivo experiment proved that chitosan nanoparticles can be combined with IL 17 specificity, inhibiting its function, so as to regulate the pathological process of asthma, reducing the airway inflammation, clinical symptoms eased.

【技术实现步骤摘要】
一种壳聚糖纳米颗粒CS-IL-17RC及其制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种壳聚糖纳米颗粒CS-IL-17RC及其制备方法。
技术介绍
支气管哮喘是全球最为关注的公共健康问题之一，被认为是仅次于癌症的全球第二大类致死和致残性疾病。目前，针对支气管哮喘主要采用吸入糖皮质激素(ICS)和变应原特异性免疫治疗(SIT)两大治疗策略。以ICS为主的哮喘控制方案，虽然可以较好控制哮喘，但并没有显著降低哮喘的发生率和死亡率，担心长时间吸入皮质激素的副作用，导致了我国哮喘患者ICS治疗依从性差。SIT虽是一种具有长期保护效应的对因治疗，但试剂标准化困难，仍有诱发严重过敏反应的可能，且治疗时间长、高费用，令许多患者望而却步。疫苗具有保护效应持久，给药方便，费用低廉等特点，因此，如能够在哮喘疫苗的研制上有所突破，可望对哮喘防治策略产生深远影响。目前，细胞因子单克隆抗体已被用来治疗诸如关节炎、变应性脑炎等多种严重自身免疫性疾病，但费用昂贵、需大剂量多次注射的缺点限制了其临床应用。正如前所述，哮喘发病率逐年增高，严重影响人类健康，尤其哮喘急性发作消耗大量医疗资源，因此，研制一种有效的疫苗应用前景巨大，其必将产生较大的社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种壳聚糖纳米颗粒CS-IL-17RC，其利用壳聚糖包裹IL-17RC蛋白，获得纳米颗粒，其直径小、作用时间长、缓慢释放，生物利用度高，生产成本低，接种方便，依从性好。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种壳聚糖蛋白纳米颗粒，其包括IL-17RC蛋白和壳聚糖纳米颗粒载体。进一步地，所述IL-17RC蛋白由mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分(片段长度为1257bp)的基因序列编码，所述IL-17RC蛋白通过重组质粒pET28a-IL-17RC进行诱导表达蛋白制备。进一步地，所述壳聚糖蛋白纳米颗粒的粒径为500-1000nm，包裹率为65％-85％。本专利技术的第二个目的是提供一种上述壳聚糖蛋白纳米颗粒在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种上述壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：(1)制备IL-17RC蛋白，其包括：1)扩增IL-17RC基因序列，对扩增产物进行回收纯化并测序；2)采用步骤1)中测序正确的IL-17RC构建重组质粒pET28a-IL-17RC；3)采用步骤2)构建的重组质粒pET28a-IL-17RC进行诱导表达蛋白并对蛋白产物进行纯化、去内毒素，获得预定浓度的IL-17RC蛋白；(2)壳聚糖溶液的配制：将壳聚糖溶于冰醋酸，加热溶解，获得壳聚糖溶液；(3)壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备：取步骤(1)制备的已知浓度的IL-17RC蛋白与预定浓度的三聚磷酸钠溶液混合、定容，在磁力搅拌下缓慢加入到步骤(2)配制的壳聚糖溶液中，磁力搅拌一段时间后，获得壳聚糖蛋白纳米颗粒。为了优化上述制备方法，本专利技术的技术措施进一步包括：进一步地，所述IL-17RC基因序列为mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分。进一步地，用于扩增IL-17RC基因序列的引物包括如SEQIDNO：1～SEQIDNO：2所示序列。进一步地，所述SEQIDNO：1～SEQIDNO：2所示序列的引物均设置酶切位点。上述引物序列及其酶切位点如下所示：上游引物P1(SEQIDNO：1)：5'-CTAGGATCCGAGAGACTGATGGAGCCT-3'；下游引物P2(SEQIDNO：2)：5'-AGTAAGCTTGCGCCTGTGGATGTACTTGT-3'；其中，划线部分为引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。进一步地，所述重组质粒pET28a-IL-17RC的构建步骤包括：分别双酶切pET28a(+)质粒和测序正确的IL-17RC，酶切产物进行连接获得重组质粒pET28a-IL-17RC，并进行酶切鉴定及测序。进一步地，所述诱导表达蛋白包括重组质粒pET28a-IL-17RC转化感受态细胞的步骤；其中，所述感受态细胞为E.coliBL21(DE3)，或者采用其他任一合适的感受态细胞。进一步地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.2～0.4wt％，三聚磷酸钠溶液的浓度为0.3～0.9wt％；更进一步地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.2wt％，三聚磷酸钠溶液的浓度为0.6wt％。进一步地，所述磁力搅拌的时间为45mim～90min，更优选为60min。本专利技术的第四个目的是提供一种用于扩增IL-17RC基因序列的引物组合物，该引物组合物扩增的目的基因为mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分(片段长度为1257bp)；其中，所述引物组合物包括如SEQIDNO：1～SEQIDNO：2所示序列，所述SEQIDNO：1～SEQIDNO：2所示序列的引物均设置酶切位点。本专利技术的第五个目的是提供一种由上述mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分的目的基因编码的IL-17RC蛋白，所述IL-17RC蛋白采用重组质粒pET28a-IL-17RC进行诱导表达蛋白制备。在本专利技术一较佳实施例中，上述壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法具体如下：1.IL-17RC基因扩增；特异性引物：上游引物P1：5'-CTAGGATCCGAGAGACTGATGGAGCCT-3'；下游引物P2：5'-AGTAAGCTTGCGCCTGTGGATGTACTTGT-3'；其中，划线部分为引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。PCR反应体系如下：PCR产物经试剂盒进行回收纯化，并测定浓度，并进行测序。2.构建pET28a-IL-17RC原核表达体系；用BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切pET28a(+)质粒和测序正确的IL-17RC，反应体系如下：酶切产物进行连接获得重组质粒pET28a-IL-17RC，进行酶切鉴定及测序。3.目的蛋白的诱导表达、SDS-PAGE鉴定及蛋白纯化；3.1重组质粒转化E.coliBL21(DE3)；(1)重组质粒转化E.coliBL21(DE3)。(2)次日挑取单个菌落，接种于含Kan的LB液体培养基，37℃，250rpm，震荡培养过夜。3.2蛋白诱导表达(1)取4mL过夜培养的菌液，按1:50比例接种至200mL含Kan的LB液体培养基，37℃，220rpm，振荡培养约3h，至对数生长期。(2)将培养基中加入2mL100mMIPTG，使终浓度为1mM，37℃，220rpm，继续振荡培养4h，并设置未添加IPTG诱导的对照组。(3)4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体沉淀。3.3包涵体制备；(1)每1g菌体湿重，用5mL裂解缓冲液重悬。(2)冰浴超声：作用时间10s，间隔时间10s，约2h，直至菌液近似透明。(3)4℃，4000rpm，离心20min，收集包涵体沉淀。(4)用包涵体洗涤缓冲液Ⅰ重悬沉淀。4℃，4000rpm，离心10min，弃上清。重复1次。(5)用包涵体洗涤缓冲液Ⅱ重悬沉淀。4℃，4000rpm，离心10min，弃上清。重复1次。(6)将包涵体沉淀置于-20℃保存。3.4蛋白的SDS-PAGE电泳；(1)样品处理：取100μL未诱导的全菌体，100μL诱导后全菌体，100μL菌液超声后上清，100μL菌液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种壳聚糖蛋白纳米颗粒，其特征在于，包括IL‑17RC蛋白和壳聚糖纳米颗粒载体。

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖蛋白纳米颗粒，其特征在于，包括IL-17RC蛋白和壳聚糖纳米颗粒载体。2.根据权利要求1所述的壳聚糖蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述IL-17RC蛋白由mIL-17RC编码区胞外段去除信号肽部分的基因序列编码，所述IL-17RC蛋白通过重组质粒pET28a-IL-17RC进行诱导表达蛋白制备。3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述壳聚糖蛋白纳米颗粒的粒径为500-1000nm，包裹率为65％-85％。4.一种如权利要求1所述的壳聚糖蛋白纳米颗粒在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。5.一种如权利要求1所述的壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备IL-17RC蛋白，其包括：1)扩增IL-17RC基因序列，对扩增产物进行回收纯化并测序；2)采用步骤1)中测序正确的IL-17RC构建重组质粒pET28a-IL-17RC；3)采用步骤2)构建的重组质粒pET28a-IL-17RC进行诱导表达蛋白并对蛋白产物进行纯化、去内毒素，获得预定浓度的IL-17RC蛋白；(2)壳聚糖溶液的配制：将壳聚糖溶于冰醋酸，加热溶解，获得壳聚糖溶液；(3)壳聚糖蛋白纳米颗粒的制备：取步骤(1)制备的已知浓度的IL-17RC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建华，吴良霞，郭盛，陈凌，王超颖，吕永莉，徐婉婷，马玉梅，
申请(专利权)人：上海市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31