一种细胞组合物及其制备方法和应用技术

本申请属于药物制剂领域，具体涉及一种细胞组合物及其制备方法和应用。本发明专利技术所提供的细胞组合物包括调节性T细胞、肠道干细胞、TGF‑α和IL‑1，以调节性T细胞和肠道干细胞作为活性细胞，实现在修复患者肠道炎症的同时还能调节免疫系统去抑制自身过度免疫，防止病情恶化，广泛适用于克罗恩病患者；本发明专利技术细胞组合物添加有TGF‑α和IL‑1等细胞因子，各组分协同作用，共同促进克罗恩病患肠道炎症的修复，治疗效果显著。

Cell composition, preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of pharmaceutical preparations, in particular relates to a cell composition, its preparation method and application. Cell composition provided by the invention comprises regulatory T cells, intestinal stem cells, TGF alpha and IL 1, with regulatory T cells and intestinal stem cells as active cells in repair in patients with intestinal inflammation but also to regulate the immune system to inhibit its excessive immunity, prevent disease progression, are widely applied to patients Crohn's disease; the cell composition is added with TGF alpha and IL 1 cytokines, components of synergy, and jointly promote the repair of intestinal inflammation in Crohn's disease patients, the treatment effect is significant.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞组合物及其制备方法和应用
本专利技术属于药物制剂领域，具体涉及一种细胞组合物及其制备方法和应用。
技术介绍
克罗恩病是一种原因不明的肠道炎症性疾病，作为炎症性肠病的主要类型，具有病程长、易复发、可侵及胃肠道任何部位和不易根治等特点。克罗恩病是一种消化道的慢性、反复发作和非特异性的透壁性炎症，病变呈节段性分布，可累及消化道任何部位，其中以末端回肠最为常见，结肠和肛门病变也较多。目前克罗恩病的治疗主要采用糖皮质激素和免疫抑制剂作为治疗药物，该法只能起到缓解病情的作用，无法有效的阻止病情的发展，更不能根治克罗恩病；而且长时间使用糖皮质激素药物会诱发如骨质疏松、高血压、高血糖和向心性肥胖等并发症，同时免疫抑制剂的长期使用，也会引起机体免疫系统失衡。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种适用于克罗恩病患者的细胞组合物，用于修复肠道炎症并抑制病情恶化。其具体技术方案如下：本专利技术提供了一种细胞组合物，包括：调节性T细胞、肠道干细胞、TGF-α和IL-1。优选的，所述调节性T细胞的细胞密度为1×107～5×107个/mL。优选的，所述肠道干细胞的细胞密度为5×106～1×107个/mL。优选的，所述TGF-α的工作浓度为20～50ng/mL。优选的，所述IL-1的工作浓度为10～50ng/mL。优选的，所述肠道干细胞为第三代至第五代肠道干细胞。优选的，所述细胞组合物的剂型为注射制剂。更优选的，所述注射制剂的溶媒为生理盐水。本专利技术还提供了一种上述细胞组合物的制备方法，将调节性T细胞、肠道干细胞、TGF-α和IL-1混合，得到所述细胞组合物。本专利技术还提供了上述细胞组合物或上述制备方法得到的细胞组合物在制备克罗恩病药物中的应用。综上所述，本专利技术所提供的细胞组合物包括调节性T细胞、肠道干细胞、TGF-α和IL-1，以调节性T细胞和肠道干细胞作为活性细胞，实现在修复患者肠道炎症的同时还能调节免疫系统去抑制自身过度免疫，防止病情恶化，广泛适用于克罗恩病患者；本专利技术细胞组合物添加有TGF-α和IL-1等细胞因子，各组分协同作用，共同促进克罗恩病患肠道炎症的修复，治疗效果显著。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1)本专利技术细胞组合物中包含肠道干细胞，这些细胞能直接分化形成新的肠道组织，替换并修复损伤的组织，从本质上进行治疗；2)本专利技术细胞组合物中的调节性T细胞、肠道干细胞、TGF-α和IL-1用于调节病患自身的免疫系统，避免因自身免疫过度而失效，保证本专利技术细胞组合物的疗效；3)本专利技术细胞组合物优选为注射制剂，采用生理盐水作为溶媒，生理盐水与人体组织的渗透压一直，避免对病患肠道组织产生损伤；4)本专利技术细胞组合物为低温保存制剂，既可避免细胞因子失活，又能很好的保持肠道干细胞和调节性T细胞的生物活性，疗效稳定。具体实施方式为了提供一种适用于克罗恩病患者的细胞组合物，用于修复肠道炎症并抑制病情恶化。本专利技术提供了一种细胞组合物，包括：调节性T细胞(Treg细胞)、肠道干细胞、TGF-α和IL-1。克罗恩病虽为良性疾病，至今仍缺乏十分有效的治疗手段，而且其具体的发病机制尚不完全清楚，目前可以确定的是机体免疫功能紊乱是导致其发生发展的主要原因之一。克罗恩病的专利技术机制从免疫学角度可认为克罗恩病是由Th1细胞和Th17细胞过度激活以及活化，导致Treg细胞缺乏为特点的肠道疾病。肠道干细胞主要位于肠黏膜上皮Lieberkunn's隐窝中，潘氏细胞上方，具备干细胞的终生自我更新与分化的基本特征。当受到外界生理或病理的信号作用后，肠道干细胞进行非对称分裂，形成一个原代干细胞和一个分化了定向祖细胞，定向祖细胞可进一步分化为具有特殊结构和功能的终末分化细胞，如：吸收细胞、杯状细胞、潘氏细胞、M细胞、内分泌细胞等，修复并重建小肠黏膜上皮屏障和消化吸收功能，肠道干细胞的这种潜能对肠道损伤后的修复十分关键。目前，国内肠道疾病常见，肠道黏膜，甚至黏膜下肌层的结构和功能受到破坏，通过干细胞技术和组织工程技术定向诱导肠道干细胞使其分化为特定的细胞以替代功能障碍的细胞或组织缺损，这可能是治疗克罗恩病的一种潜在的有效方法。本专利技术细胞组合物中包含肠道干细胞，这些细胞能直接分化形成新的肠道组织，替换并修复损伤的组织，从本质上进行治疗。为了避免病患因自身免疫过度而影响肠道干细胞发挥作用，保证其稳定的疗效，本专利技术组合物中还添加了调节性T细胞、TGF-α和IL-1用于调节病患自身的免疫系统。Treg细胞是一类调节性T细胞(RegulateryTcell)，对机体免疫起着抑制作用，能抑制对自身或外源抗原有害的免疫反应。Treg表达CD4、CD25和转录因子FoxP3。本专利技术对调节性T细胞、肠道干细胞、TGF-α和IL-1的来源不作特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的即可，如市售来源；或者采用本领域技术人员熟知的常规技术手段进行制备得到的调节性T细胞、肠道干细胞、TGF-α和IL-1即可。下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。以下实施例中的英夫利昔单抗和免疫抑制剂均来源于南方医科大学附属医院京溪南方医院。ELISAKit购买于碧云天生物科技有限公司。实施例11、肠道干细胞的分离提取，参考：叶章群,刘冠琳,陈志强.小鼠肠干细胞群的构建.《华中科技大学学报(医学版)》[J]，2006。取P2代至P5代的肠道干细胞，吸去培养基，加入0.25％胰酶常规消化，然后制成细胞密度为1×105个/mL的细胞悬液，接着将5μL抗Lgr5的单克隆抗体加入500μL的细胞悬液中，接着在室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照；孵育完毕后1500r/min离心5min，弃上清，再用含10％FBS的PBS洗涤2遍，再用500μL的PBS重悬后上机检测。肠道干细胞的表面抗原检测结果如以下表1所示：表1Lrg5+第一次检测95.6％第二次检测98.4％第三次检测96.4％2、调节性T细胞的培养，参考：马小倩,李桑,王维.体外扩增后脐血来源Treg细胞的有效性及安全性研究.《生命科学研究》[J],2016,20(4):333-339。取Treg细胞，制成1×106个/mL的细胞悬液，分别取抗人CD25、CD4、CD45RO的单克隆抗体各5μL，加入500μL细胞悬液中，室温下避光孵育20min，同时设立空白对照组；孵育完毕后1500r/min离心5min，弃上清，再用含10％FBS的PBS洗涤2遍，再用500μL的PBS重悬后上机检测。Treg细胞的表面抗原检测结果如表2所示：表2CD25+CD4+CD45RO+第一次检测94.1％96.8％第二次检测93.7％95.8％第三次检测95.8％96.5％3、按照表3所述配方分别配制A、B和C三种细胞组合物，其具体制备过程为：取肠道干细胞和调节性T细胞，采用生理盐水作为溶剂制成混合细胞悬液，然后依次加入TGF-α和IL-1。表3实施例21、随机选取120只体重相近的SPF级的小鼠，把小鼠分成6组，每组20只(雌雄各半)；然后，对各小鼠进行三硝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞组合物，其特征在于，包括：调节性T细胞、肠道干细胞、TGF‑α和IL‑1。

【技术特征摘要】
1.一种细胞组合物，其特征在于，包括：调节性T细胞、肠道干细胞、TGF-α和IL-1。2.根据权利要求1所述的细胞组合物，其特征在于，所述调节性T细胞的细胞密度为1×107～5×107个/mL。3.根据权利要求1所述的细胞组合物，其特征在于，所述肠道干细胞的细胞密度为5×106～1×107个/mL。4.根据权利要求1所述的细胞组合物，其特征在于，所述TGF-α的工作浓度为20～50ng/mL。5.根据权利要求1所述的细胞组合物，其特征在于，所述IL-1的工作浓度为10～50ng/mL。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：马颖，
申请(专利权)人：广东颜值科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44