核酸的活性染料偶联标记、检测及提纯方法技术

本发明专利技术涉及一种核酸的活性染料偶联标记方法，包括以下步骤：通过基因克隆或基因合成的方式获得DNA分子，通过基因合成的方式获得RNA分子；配制Tris‑HCl溶液，称取定量的活性染料加入所述Tris‑HCl溶液中溶解制得染液，取定量的染液与DNA分子或RNA分子置于EP管中混合，随后用枪头轻轻吹打均匀，于水浴锅中孵育20min，制得活性染料偶联标记核酸。本发明专利技术方法打破了传统借助荧光染料嵌入核酸双链的激发显色的方法，具有结合稳定性高、显色直观、安全高效、经济等特点。

Coupling labeling, detection and purification of reactive dyes of nucleic acid

Reactive dye coupling marking the invention relates to a method of nucleic acid, which comprises the following steps: obtaining DNA molecules by way of gene cloning and gene synthesis, RNA molecules by gene synthesis; preparation of Tris HCl solution, called reactive dyes from quantitative to the dissolution of Tris HCl prepared dye, dye with DNA or RNA molecules in EP molecular quantitative tube mixed, then the gun head gently in army uniform, in a water bath and incubated for 20min prepared activated dye coupling labeled nucleic acid. The method breaks the traditional method of excitation color rendering by using fluorescent dye embedded nucleic acid double chains, and has the characteristics of high stability, color rendering, safety, efficiency and economy.

【技术实现步骤摘要】
核酸的活性染料偶联标记、检测及提纯方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种核酸的活性染料偶联标记、检测及提纯方法。
技术介绍
随着分子诊断技术的快速发展，基于核酸的快速检测已成为分子诊断学领域关键的技术，如何快速检测核酸的变化并直观显示是该领域亟待解决的问题。琼脂糖凝胶是核酸检测中主要用的一种电泳技术，在电场的作用下，核酸分子向阳极迁移，其迁移速率与核酸分子的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等相关。借助嵌入核酸中的染料及其激发光可鉴定核酸的位置及其表达量，如溴化乙锭(EthidiumBromide,EB)。随着分子生物技术的快速发展，多种新型的核酸染料被开发，如SYBRGreenI、Genefinder和Geneview等，虽然各种染料的激化波段不同，但均存在以下问题：1、安全性差：市面上商业化核酸染料均可直接嵌入核酸分子，如果不慎引入人体，可能导致潜在的遗传变异，具有潜在的致癌性；2、定量化存在偏差：由于核酸染料直接嵌入核酸分子，导致核酸的整体分子量及迁移率发生了变化；3、依赖紫外等激发光：目前市面上商业化核酸染料均需要激发光激发，每种激发光均对人体及眼睛产生危害；4、设备依赖性高：由于紫外等激发光具有一定的人体危害性，因此需要依赖一定的保护装置进行保护，必须有专业的设备才能检测，检测成本大大提高。如何实现核酸分子的快速标定及可视化展示是目前核酸分子检测亟待解决的难题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种核酸的活性染料偶联标记、检测及提纯方法，用以解决现有技术中的核酸检测过程安全性差、定量化存在偏差、依赖激发光和依赖额外设备的问题。本专利技术一方面提供了一种核酸的活性染料偶联标记方法，包括以下步骤：1)核酸的获得a、通过基因克隆或基因合成的方式获得DNA分子；b、通过基因合成的方式获得RNA分子；2)核酸的变性及活性染料的偶联标记a、配制pH值为6.0-9.0的Tris-HCl溶液(浓度为0.5M)；b、称取定量的活性染料加入所述Tris-HCl溶液中溶解制得染液，其中活性染料的浓度为5％；c、取定量的染液与步骤1)中制得的DNA分子或RNA分子置于EP管中混合，随后用枪头轻轻吹打均匀，于60-90℃水浴锅中孵育20min，制得活性染料偶联标记核酸，其中染液与DNA分子或RNA分子的体积比为1:4。进一步的，所述通过基因克隆的方式获得DNA分子具体为获取目的DNA序列全长，可借助PCR反应获得基因全长。进一步的，所述通过基因合成的方式获得DNA分子步骤之前还包括获取DNA序列全长，所述通过基因合成的方式制备RNA分子步骤之前还包括获取RNA序列全长。进一步的，所述活性染料为卤代均三嗪类、乙烯砜类、卤代嘧啶类、多活性基染料中的一种。本专利技术的另一方面提供一种活性染料偶联标记核酸的检测方法，包括以下步骤：1)称取定量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中轻轻混匀，两次微波炉加热至完全熔化得到凝胶，待凝胶温度降低至60℃左右倒入已插好梳子的板中，待凝胶凝固后，转移至电泳槽中，并加入1×TAE缓冲液没过凝胶表面；2)取活性染料偶联标记核酸进行点样，每孔点样10μl，在电压100V的条件下电泳20-30min；3)电泳结束后，用肉眼直接观察实验结果。本专利技术的另一方面提供一种核酸的提纯方法，具体步骤为：切取目的核酸分子所在的条带并称重，用琼脂糖凝胶核酸快速回收试剂盒对目的核酸分子进行回收，得到纯化后的核酸。本专利技术的另一方面提供一种核酸的提纯方法，具体步骤为：切取目的核酸胶条并熔解，加入到色谱柱中，用洗脱液对核酸进行洗脱，收集洗脱液获得纯化后的核酸。进一步的，所述色谱柱为分子筛色谱柱。采用上述本专利技术技术方案的有益效果是：本专利技术结合有机化学共价偶联标记的原理，利用活性染料的活性基团与与核糖核酸(Ribonucleicacid,RNA)和脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid,DNA)的-NH2亲核加成或亲核取代而标记不同颜色，DNA和RNA分子链的中的碱基A、碱基C、碱基G上带有游离的氨基，活性染料可以与之发生亲和加成或者亲和取代应从而进行共价偶连标记。在核酸分子链发生变性解链时大量的氨基暴露出来，参与活性染料偶联反应。核酸分子在退火后，重新恢复其原始结构状态，此时活性染料与之紧密结合，进而实现核酸的直接彩色显示，打破了传统借助荧光染料嵌入核酸双链的激发显色的方法，具有结合稳定性高、安全高效、经济等特点，同时，活性染料偶联标记的核酸显色直观，检测过程简便，具体原理如下：1、稳定性好：活性染料是一类带有活性基团的水溶性染料，可借助其活性基团与核酸上碱基的氨基发生共价键偶联而形成稳定的化合物。2、依赖性小：由于活性染料偶联标记的核酸可直接依赖肉眼进行观察，不需要如凝胶成像仪等大型设备进行图像采集，可大大节约实验成本。3、安全性好：活性染料与核酸进行偶联结合形成稳定的共价键，该过程需要严格的实验条件，并不会直接嵌入到核酸分子。因此，不存在人体安全隐患，而且对环境不造成严重污染。4、定量化分析方便：活性染料与核酸共价偶联比较紧密，可借助分子筛等进行分离纯化且实现每个核酸条带的准确定量，结合DIY方式可获得精确的彩色核酸条带，通过该核酸分子量标准可准确实现待测核酸样本的定量化分析。5、肉眼直接观察：采用活性染料共价偶联标记的核酸检测时可直观地显示出彩色核酸条带，借助肉眼即可实现直观可视化显示，克服了传统依赖紫外设备造成的潜在安全隐患。附图说明图1为DNA链碱基结构示意图；图2为RNA链碱基结构示意图；图3为活性染料偶联标记示意图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本专利技术主要利用活性染料的活性基团与图1和图2所示的核酸(DNA或RNA)上碱基的氨基发生共价键偶联而形成稳定的化合物的原理，本专利技术一个实施例提供了一种核酸的活性染料偶联标记方法，包括以下步骤：1)核酸的获得：a、通过基因克隆或基因合成的方式获得DNA分子；b、通过基因合成的方式获得RNA分子；2)核酸的变性及活性染料的偶联标记，流程如图3所示：a、配制pH值为6.0-9.0的Tris-HCl溶液(浓度为0.5M)；b、称取定量的卤代均三嗪类染料加入10mlTris-HCl溶液中溶解制得染液，其中卤代均三嗪类染料的浓度为5％；c、取定量的2μl染液与8μl步骤1)中制得的DNA分子置于EP管中混合，随后用枪头轻轻吹打均匀，于60℃水浴锅中孵育20min，制得活性染料偶联标记核酸。上述实施例中，具体的，所述通过基因克隆的方式获得DNA分子具体为获取目的DNA序列全长，可借助PCR反应获得基因全长。上述实施例中，具体的，所述通过基因合成的方式获得DNA分子步骤之前还包括获取DNA序列全长，所述通过基因合成的方式制备RNA分子步骤之前还包括获取RNA序列全长。该实施例，利用活性染料的活性基团与核酸的-NH2亲核加成或亲核取代而标记不同颜色，进而实现核酸的直接彩色显示，打破了传统借助荧光染料嵌入核酸双链的激发显色的方法，具有结合稳定性高、安全高效、经济的特点。本专利技术的另一个实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸的活性染料偶联标记方法，其特征在于，包括以下步骤：1)核酸的获得a、通过基因克隆或基因合成的方式获得DNA分子；b、通过基因合成的方式获得RNA分子；2)核酸的变性及活性染料的偶联标记a、配制pH值为6.0‑9.0的Tris‑HCl溶液(浓度为0.5M)；b、称取定量的活性染料加入所述Tris‑HCl溶液中溶解制得染液，其中活性染料的浓度为5％；c、取定量的染液与步骤1)中制得的DNA分子或RNA分子置于EP管中混合，随后用枪头轻轻吹打均匀，于60‑90℃水浴锅中孵育20min，制得活性染料偶联标记的核酸，其中染液与DNA分子或RNA分子的体积比为1:4。

【技术特征摘要】
1.一种核酸的活性染料偶联标记方法，其特征在于，包括以下步骤：1)核酸的获得a、通过基因克隆或基因合成的方式获得DNA分子；b、通过基因合成的方式获得RNA分子；2)核酸的变性及活性染料的偶联标记a、配制pH值为6.0-9.0的Tris-HCl溶液(浓度为0.5M)；b、称取定量的活性染料加入所述Tris-HCl溶液中溶解制得染液，其中活性染料的浓度为5％；c、取定量的染液与步骤1)中制得的DNA分子或RNA分子置于EP管中混合，随后用枪头轻轻吹打均匀，于60-90℃水浴锅中孵育20min，制得活性染料偶联标记的核酸，其中染液与DNA分子或RNA分子的体积比为1:4。2.根据权利要求1所述的核酸的活性染料偶联标记方法，其特征在于，所述通过基因克隆的方式获得DNA分子具体为获取目的DNA序列全长，可借助PCR反应获得基因全长。3.根据权利要求1所述的核酸的活性染料偶联标记方法，其特征在于，所述通过基因合成的方式获得DNA分子步骤之前还包括获取DNA序列全长，所述通过基因合成的方式制备RNA分子步骤之前还包括获取RNA序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴永红，
申请(专利权)人：苏州泽科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32