测序文库构建中5’和3’接头连接副产物的去除方法技术

本发明专利技术涉及测序文库构建中5’和3’接头连接副产物的去除方法。具体而言，本发明专利技术提供一种切割RNA‑DNA：cDNA杂交双链体的方法，所述方法包括混合Cas酶、sgRNA和所述RNA‑DNA：cDNA杂交双链体的步骤；其中，该杂交双链体中的DNA部分包含该Cas酶识别的前间区序列邻近基序(PAM序列)；该sgRNA能特异性结合该cDNA链的一部分；和该Cas酶能特异性识别该sgRNA，并切割所述杂交双链体；任选地，所述RNA‑DNA：cDNA杂交双链体产生于RNA测序文库的构建过程中；以及任选地，所述RNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’接头，所述DNA为RNA测序文库构建过程中使用的3’接头。

Removal of joint by-products of 5 'and 3' joint in the construction of sequence library

The present invention relates to a method for removing the 5 'and 3' joint by-products in the construction of a sequencing library. Specifically, the present invention provides a method for cutting RNA DNA:cDNA hybrid duplexes, said method comprising mixing a Cas enzyme, sgRNA and the RNA DNA:cDNA hybrid duplexes steps; among them, part of the DNA hybrid duplexes of Cas including the enzyme recognition before region sequences adjacent motif (PAM sequence); the sgRNA can specifically bind to the cDNA part of the chain; and the Cas enzyme can specifically recognize the sgRNA, and cutting the hybrid duplexes; optionally, the construction process of the RNA DNA:cDNA hybrid duplexes from RNA sequencing library; and any preferably, the RNA is used in the process of the construction of RNA sequencing library 5 \joint, the DNA is used in the process of the construction of RNA sequencing library 3\ joint.

【技术实现步骤摘要】
测序文库构建中5’和3’接头连接副产物的去除方法
本专利技术属于核酸测序领域，尤其是基于接头连接的RNA测序，具体涉及测序文库构建中5’和3’接头连接副产物的去除方法。
技术介绍
RNA深度测序(deepsequencing)的cDNA文库构建方法主要包括随机引物或oligo-dT引物反转录法和两步接头连接反转录法〔Reuter,J.A.，D.V.Spacek和M.P.Snyder，High-ThroughputSequencingTechnologies，MolecularCell，2015，58(4):p.586-597〕。前者通常用于mRNA等长转录本RNA的建库，而后者的应用更为广泛，适用于包括打断的长转录本RNA在内的任何适合连接反应的RNA深度测序文库的构建，例如小RNA测序〔Munafo,D.B.和G.B.Robb，OptimizationofenzymaticreactionconditionsforgeneratingrepresentativepoolsofcDNAfromsmallRNA，RNA，2010，16(12):p.2537-52〕、CLIP测序〔Lic本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种切割RNA‑DNA：cDNA杂交双链体的方法，其特征在于，所述方法包括混合Cas酶、sgRNA和所述RNA‑DNA：cDNA杂交双链体的步骤；其中，该杂交双链体中的DNA部分包含该Cas酶识别的前间区序列邻近基序(PAM)；该sgRNA能特异性结合该cDNA链的一部分；和该Cas酶能特异性识别该sgRNA，并切割所述杂交双链体；任选地，所述RNA‑DNA：cDNA杂交双链体产生于RNA测序文库的构建过程中；以及任选地，所述RNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’接头，所述DNA为RNA测序文库构建过程中使用的3’接头。

【技术特征摘要】
1.一种切割RNA-DNA：cDNA杂交双链体的方法，其特征在于，所述方法包括混合Cas酶、sgRNA和所述RNA-DNA：cDNA杂交双链体的步骤；其中，该杂交双链体中的DNA部分包含该Cas酶识别的前间区序列邻近基序(PAM)；该sgRNA能特异性结合该cDNA链的一部分；和该Cas酶能特异性识别该sgRNA，并切割所述杂交双链体；任选地，所述RNA-DNA：cDNA杂交双链体产生于RNA测序文库的构建过程中；以及任选地，所述RNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’接头，所述DNA为RNA测序文库构建过程中使用的3’接头。2.一种去除RNA测序文库构建时产生的5’和3’接头连接副产物的方法，或构建RNA测序文库的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)使用3’接头和5’接头与待测序RNA进行连接反应，获得连接反应的产物；(2)对步骤(1)获得的产物进行反转录，获得反转录产物；和(3)使步骤(2)获得的反转录产物与Cas酶和sgRNA混合，从而除去反转录产物中5’和3’接头连接副产物；其中，所述3’接头含有所述Cas酶所识别的PAM序列；所述sgRNA能特异性结合反转录产生的cDNA链的一部分；和所述Cas酶能特异性识别所述sgRNA，并切割所述5’和3’接头连接副产物。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA序列由靶标区和Cas识别区组成，其中，靶标区的碱基序列由所述RNA-DNA序列上长15～25个碱基、优选长18～22个碱基的片段组成，该片段紧邻该PAM序列的第1个碱基，或该片段的最后1个碱基与该PAM序列第1个碱基之间隔开8个以内、优选5个以内的碱基；优选地，所述PAM序列的第1个碱基为所述DNA紧邻所述RNA的第1个碱基，所述sgRNA的靶标区由所述RNA靠近所述DNA一侧的15～25个碱基组成，或由与所述PAM序列的第1个碱基隔开8个碱基以内的所述RNA的长15～25个碱基的片段组成；或者，所述PAM序列的第1个碱基为所述DNA靠近所述RNA一侧的第m个碱基，m≥2，所述sgRNA的靶标区由跨所述RNA和所述DNA的片段组成。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA序列由靶标区和Cas识别区组成，其中，靶标区的碱基序列由所述5’和3’接头连接副产物上长15～25个碱基、优选长18～22个碱基的片段组成，该片段紧邻该PAM序列的第1个碱基，或该片段的最后1个碱基与该PAM第1个碱基之间隔开8个以内、优选5个以内的碱基；优选地，所述PAM序列的第1个碱基为所述3’接头紧邻所述5’接头的第1个碱基，所述sgRNA的靶标区由所述5’接头靠近3’接头一侧的15～25个碱基组成，或由与该PAM第1个碱基隔开8个碱基以内的所述5’接头的长15～25个碱基的片段组成；或者，所述PAM序列的第1个碱基为所述3’接头靠近5’接头一侧的第m个碱基，m≥2，所述sgRNA的靶标区由跨所述5’接头和所述3’接头的片段组成。5.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述Cas酶选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴立刚，杨其元，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31