一株新青霉菌及其代谢产物安他拟酸A制造技术

本发明专利技术涉及一株来源于土壤的新青霉菌Z08及其代谢产物安他拟酸A，该菌从种植玉米的土壤中分离得到，使用ITS引物扩增得到ITS序列，经BLAST鉴定,该株菌为青霉菌(

A strain of fungi and their metabolites Xinqing he quasi acid A

The invention relates to a strain from soil fungi Z08 and its metabolites in Xinqing he intends to acid A, the bacteria isolated from maize soil, amplified ITS sequences using ITS primers were identified by BLAST, the strains of Penicillium (

【技术实现步骤摘要】
一株新青霉菌及其代谢产物安他拟酸A
本专利技术涉及一株来源于土壤并能产生新天然产物安他拟酸的青霉菌Z08及其在医药、林业及农业上的应用。
技术介绍
土壤微生物在土壤中度过它们全部或者部分的生命历程,并在土壤内部各种过程中发挥着重要作用,这些作用在许多方面影响人类的社会和经济发展。很多土壤微生物可以分泌次生代谢产物，如根瘤菌分泌根瘤菌结瘤因子——脂壳寡糖，在根瘤菌与植物的共生结瘤过程中起重要作用。真菌天然产物还是天然药物的重要来源之一1，2，如麦角生物碱，二酮哌嗪，喹啉，喹唑啉，地西泮，和聚酮化合物等。大规模真菌基因组序列测序的完成表明真菌具有产生丰富的次级代谢产物的潜能，这类次生代谢产物已经成为了研究的热点和开发的方向3，4，5。人们在20世纪初开始注意到微生物与土壤肥力之间的关系，并发现一些难溶性的复合物施入土壤中，可以被作为磷源而应用，人们从土壤中筛选出50多株细菌，其中几株青霉菌在平板上形成了肉眼可见的溶磷圈6。随着工业污染和环境破坏的日益严重，恶性肿瘤发病率正在逐年提高，而常规抗癌药物又具有很大的副作用，所以抗肿瘤药物的研发是药物化学研究领域研究的重要课题。真菌天然产物表现出十分广泛的生物学活性，包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫抑制等。据报道7草酸青霉菌P8,具有溶解土壤中多种难溶磷的作用,适合南方的红壤、北方的黑土、褐土、潮土等多种土壤类型,具有提高作物产量,活化土壤难溶磷、防止磷肥的土壤化学固定,提高磷肥利用效率的多种作用功能。马忠岩等8在公开的专利技术专利中指出，对番茄苗根部周围撒播淡紫拟青霉菌菌剂处理，能够显著促进番茄的生长，且效果稳定，具有很好的推广应用前景。利用淡紫拟青霉菌株FJAT-9041制备辛硫磷的降解菌剂，能有效地降解农药辛硫磷9。田间试验表明，接种溶磷菌-青霉菌可以增加玉米产量10。草酸青霉菌NJDL-03可修复土壤铅污染及提高石灰性土壤磷素利用率，在促进作物生长方面效果显著11。细脚拟青霉菌株培养产物具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、护肝、改善营养、抗衰老、提高耐缺氧能力、镇静、镇痛等功能12。由此可见，青霉菌在农业与医药等方面均具有广阔的应用前景。因此，有必要进一步对青霉菌及其代谢产物进行研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于土壤的新的青霉菌(Penicililliumflavonim)Z08，该青霉菌于2016年6月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.12761。本专利技术从种植玉米的土壤中分离得到一株真菌，该菌使用ITS引物扩增得到ITS序列，经BLAST鉴定，结果显示该序列和Penicililliumsp.1JJK-2011(GENEBankID：HM469397)相似度最高，达到98.9％，故鉴定该株菌属于青霉属(Penicililliumflavonim)的青霉菌Z08。该菌的微生物学特征为：在PDA平板上28℃培养4天后，菌落呈现白色，多为营养菌丝。其营养体为无色或淡黄色的菌丝体，菌丝各细胞之间有横隔膜。7天后可见气生菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗，顶端以特殊的对称的扫帚状的分支，同时菌落呈现淡绿色，显微镜检可见成团菌丝体。本专利技术的另一目的是提供从该真菌中分离得到的一个新化合物安他拟尼酸A(antanicacidA)，其化学名称为:(E)-2-(2-(3-(2-氨基苯甲酰胺)；分子式为:C15H17N3O6，分子量为:335.1117；化学结构如下:该化合物为淡黄色无定形粉末，易溶于水，二甲基亚砜等。本专利技术的优点和积极效果：(1)本专利技术在土壤中分离得到的新青霉菌Z08，其具有很好的解磷功效，能够溶解土壤中多种难溶磷,在种植农作物的土壤中使用，能够活化土壤难溶磷、防止磷肥的土壤化学固定,提高作物产量。(2)本专利技术在新青霉菌Z08发酵产物中提取得到一新的化合物安他拟酸A，该化合物能够抑制NIH3T3细胞繁殖，安他拟酸A浓度越大，对NIH3T3细胞增殖的抑制作用就越明显；同时，安他拟酸A对NIH3T3细胞TGF-β1基因表达也有较强的抑制作用，该化合物有望在治疗糖尿病的药物中得以应用，为糖尿病患者的治疗提供新产品。(3)本专利技术提取的安他拟酸A能够抑制脂多糖诱导的巨噬细胞分泌炎症因子，还有望在治疗抗炎的药物中得以应用。附图说明图1为安他拟酸A化合物1H核磁共振图谱。图2为安他拟酸A化合物13C图谱。图3为安他拟酸A化合物1H-13CHMQC图谱。图4为安他拟酸A化合物1H-13CHMBC图谱。图5为安他拟酸A化合物1H-1HCOSY图谱。图6为安他拟酸A化合物高分辨质谱。图7为青霉菌Z08对土壤磷的溶解动态分析图。图8为NIH3T3细胞中提取的总RNA质量检测分析图。图9为安他拟酸A三个浓度对RAW264.7细胞活性的影响图。图10为安他拟酸A三个剂量对LPS诱导小鼠细胞NO的生成情况图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的描述，以便是本领域技术人员更加清楚明白，但并不构成对本专利技术的任何限制。实施例1一、青霉菌Z08菌株的分离与鉴定从吉林省九台市张家农场土壤中应用PDA+青霉素和链霉素平板分离得到了21株真菌，其中一株真菌即青霉菌Z08，青霉菌Z08在PDA琼脂糖平板上可产生淡黄色化合物。该菌株经分类学研究和分子生物学研究鉴定为青霉菌(Penicililliumflavonim)。该菌的微生物学特征为：在PDA平板上28℃培养4天后，菌落呈现白色，多为营养菌丝。其营养体为无色或淡黄色的菌丝体，菌丝各细胞之间有横隔膜。7天后可见气生菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗，顶端以特殊的对称的扫帚状的分支，同时菌落呈现淡绿色，显微镜检可见成团菌丝体。1、青霉菌Z08菌株的制备青霉菌纯化采用如下培养基：在1000毫升水中加入土豆培养基40克，加入葡萄糖20克，琼脂20克，在121℃,压力为1kg/cm2条件下灭菌20分钟，冷却后加入无菌的青霉素和链霉素各30微克/毫升。无菌状态下称取土壤样本约l克，加入无菌水10毫升，震荡混匀，再分别稀释10倍、100倍、100倍共制成4个浓度梯度的样品，各取0.25毫升涂布于固体培养基上，每个梯度涂布20个平板，当分离菌株在培养基上进入生长旺盛期时，挑取菌株的孢子，在真菌纯化培养基上划线纯化，28℃、相对湿度90％、恒温恒湿条件下倒置培养，按此方法连续划线直至单个平板上为形态单一的菌落时，挑取平板上的单菌落进行纯培养，待菌落长成后保存纯种。2、青霉菌Z08的基因组DNA提取首先将菌株在28℃摇床(150r/min)培养7天，然后取冷冻干燥后的菌丝100mg，加适量的液氮于研钵中充分研磨，并加入2ml缓冲液(50mMTris-HClpH7.2，50mMEDTA，2.5％SDS,1％β-巯基乙醇)，混匀，转移至10mL试管中，加入2mL苯酚：氯仿(1:1)抽提液，提取，提取液离心，然后取上清液加入50微升RNase，55℃条件下，放置1小时并加入蛋白酶。然后用70％冷乙醇洗两次，室温干燥30分钟，加入500微升水溶解，-80℃保存备用。3、青霉菌Z08菌株鉴定通过引物ITS58A1F:5’-GC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株新青霉菌(Penicilillium flavonim)Z08，其特征在于，其保藏号为：CGMCC NO.12761。

【技术特征摘要】
2016.08.15 CN 201610667807X1.一株新青霉菌(Penicililliumflavonim)Z08，其特征在于，其保藏号为：CGMCCNO.12761。2.如权利要求1所述的一株新青霉菌(Penicililliumflavonim)Z08，其特征在于，能够分离得到一个新化合物安他拟尼酸A。3.根据权利要求2所述的一株新青霉菌(Penicililliumflavonim)Z08，其特征在于，所述安他拟尼酸A，其化学名称为:(E)-2-(2-(3-(2-氨基苯甲酰胺)；分子式为:C15H17N3O6，分子量为:335.1117；化学结构为:该化合物为淡黄色无定形粉末，易溶于水，二甲基亚砜。4.一种生产安他拟尼酸A的方法，其特征在于：发酵培养权利要求1所述的青霉菌Z08，获得含有该安他拟尼酸A的青霉菌Z08发酵物，从该发酵物中分离安他拟尼酸A。5.根据权利要求4所述的一种生产安他拟尼酸A的方法，其特征在于：具体生产方法包括以下步骤：①发酵物的制备取青霉菌Z08的孢子划线列于8升PDA的琼脂平板上：取酵母提取物0.5克，葡萄糖10.0克，磷酸钙5.0克，硫酸铵0.5克，氯化钾0.2克，硫酸镁0.1克，硫酸锰0.0001克，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑毅男，丁传波，张伟，刘文丛，赵婷，
申请(专利权)人：郑毅男，
类型：发明
国别省市：吉林,22