一种检测牛奶中残留氨基糖苷类抗生素的前处理方法技术

本发明专利技术属分析化学领域，涉及检测牛奶中氨基糖苷类抗生素残留的前处理方法，其包括合成硼酸修饰的介孔磁性石墨烯复合材料，两步后嫁接反应，将APB与GLYMO反应得GLYMO‑APB，将其嫁接在介孔磁性石墨烯复合材料表面得硼酸修饰的介孔磁性石墨烯复合材料，所述复合材料的介孔内壁修饰的硼酸功能基团可通过硼酸与糖苷类小分子的邻二醇结构相互作用选择性地与牛奶中的氨基糖苷类药物相结合，同时排除牛奶基质中脂肪、蛋白质等生物大分子的干扰。本方法利用特异的硼酸‑氨基糖苷作用对牛奶中残留抗生素进行富集，克服了耗时、选择性不强、基质干扰严重等问题。

A pretreatment method for the determination of residual aminoglycoside antibiotics in milk

The invention belongs to the field of chemical analysis, relates to a pretreatment method of aminoglycoside antibiotic residues in milk, including the synthesis of boric acid modified mesoporous magnetic graphene composite materials, the two step after the grafting reaction, the APB reaction with GLYMO GLYMO APB, the grafted on mesoporous magnetic graphene composite dielectric surface the hole magnetic graphene composites have boronic acid modified, boric acid functional group modified mesoporous wall of the composite material can be combined by diol boric acid and glycoside structure of small molecules selectively with milk in the interaction of aminoglycoside drugs, and to eliminate the interference of biological macromolecules such as milk fat and protein matrix the. This method uses the specific role of boric acid enrichment of aminoglycoside antibiotic residues in milk, and overcomes the problems of time-consuming, selectivity is not strong, serious matrix interference etc..

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛奶中残留氨基糖苷类抗生素的前处理方法
本专利技术属于分析化学领域，涉及检测牛奶中残留氨基糖苷类抗生素的前处理方法，具体涉及一种基于硼酸修饰介孔磁性石墨烯复合材料富集检测牛奶中氨基糖苷类抗生素的前处理方法。本方法利用硼酸作为功能基团的吸附剂能快速排除牛奶该复杂生物样品中内源干扰并选择性地富集氨基糖苷类抗生素。
技术介绍
现有技术公开了氨基糖苷类抗生素（Aminoglycosides）是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的糖苷类抗生素。该类抗生素在养殖业、畜牧业中被广泛应用于防治家畜家禽的霍乱、伤寒、大肠杆菌病等一系列感染。然而，此类动物性食品中的氨基糖苷类抗生素的残留却会对人体造成不良影响。研究显示，长时间的摄入低剂量抗生素残留的动物性食品，会造成抗生素在人体内蓄积，造成听力和肾脏损害、引起各种组织器官病变。随着人民生活水平的提高，牛奶在人们的日常饮食结构中占有比例逐年增加，然而牛奶中抗生素残留的问题却不容乐观。为了保障食品安全以及消费者的健康，目前许多国家和地区都出台了相关规定对牛奶中的氨基糖苷类抗生素做出了最大残留限量（MRL）的规定。而在实际分析检测的工作中，牛奶这一复杂生物基质，由于其含有大量脂肪、蛋白、矿物质等内源性物质，且抗生素残留量极低，使得有关研究遇到重重瓶颈。传统的生物样品前处理方法包括基于疏水性固定相（C8、C18）或离子交换固定相的固相萃取，但是这些方法往往存在着耗时、大量使用有机溶剂、缺少对目标分子的选择性等缺陷。磁性限进介质固相萃取（MRAM-SPE，RAM-MSPE）是近年来兴起的一种新型样品前处理技术，其融合了限进介质固相萃取与磁性分离技术的优点，包括具有亲水性的外表层的磁性吸附剂，通过特定的吸附剂孔径而排阻生物大分子的干扰，通过施加外部磁场以达到吸附剂与基质的分离等等。此外，硼酸作为功能基团的亲和色谱柱在蛋白质组学研究中已经被广泛应用于糖蛋白的富集，其原理主要是硼酸与糖链上的邻羟基结构可以形成可逆的共价键。含糖环结构的分子可以与硼酸功能化的吸附剂可逆的结合、洗脱。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供新的涉及检测牛奶中残留氨基糖苷类抗生素的前处理方法，具体涉及一种基于硼酸修饰介孔磁性石墨烯复合材料富集检测牛奶中氨基糖苷类抗生素的前处理方法。本方法利用硼酸作为功能基团的吸附剂能快速排除牛奶该复杂生物样品中内源干扰并选择性地富集氨基糖苷类抗生素。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决现有技术中存在的耗时、大量使用有机溶剂、缺少对目标分子的选择性等缺陷，提供新的检测牛奶中残留氨基糖苷类抗生素的前处理方法，尤其涉及一种基于硼酸修饰介孔磁性石墨烯复合材料富集检测牛奶中氨基糖苷类抗生素的前处理方法。本专利技术通过一个两步的后嫁接合成路线合成了硼酸修饰介孔磁性石墨烯复合材料并用于选择性地富集复杂生物样品中的小分子药物残留——氨基糖苷类抗生素。所述复合材料具有巨大的比表面积、均匀的孔径分布以及良好的磁响应性，并在介孔内壁修饰以硼酸官能基团；本专利技术以所述复合材料用作磁性限进介质固相萃取吸附剂富集牛奶中氨基糖苷类抗生素时，将材料加入粗去蛋白的牛奶基质中混合分散，小分子氨基糖苷类抗生素可以进入介孔内并与硼酸基团结合，而牛奶基质中的内源性大分子如蛋白，脂肪等则由于尺寸排阻效应无法进入介孔，吸附了目标分子的材料可以在外加磁场中被快速分离，而后再加以适当的洗脱溶剂即可将目标分子洗脱下来，进行检测。具体而言，本专利技术的一种检测牛奶中残留氨基糖苷类抗生素的前处理方法，其包括步骤：1）合成3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（GLYMO）-氨基苯硼酸（APB）：在低温下进行反应投料而后升温反应，将GLYMO上连接APB；2）合成介孔磁性石墨烯复合材料（MCM-41型材料）：将石墨烯均匀分散在浓硝酸中进行酸化处理，而后在所得的酸化石墨烯表面通过反应修饰以四氧化三铁微球得到磁性石墨烯，再在其上一步包覆上介孔硅；3）合成硼酸修饰的介孔磁性石墨烯复合材料：向GLYMO-APB溶液中加入介孔磁性石墨烯复合材料，升温反应完成对材料的硼酸修饰；4）利用硼酸修饰的介孔磁性石墨烯复合材料提取富集牛奶中的氨基糖苷类抗生素：向粗去蛋白及脂肪的牛奶基质中加入所得的复合材料，充分混合使目标分子进入材料孔道内壁并与硼酸基团结合，在磁场作用下收集结合了目标分子的材料，再向收集的材料中加入适当洗脱液将目标分子洗脱下来，洗脱液过滤后可直接进行色谱检测。本专利技术的实施例中，将10-500mgAPB溶解于10-100mL溶剂中，并调节溶液pH至8-10。本专利技术的实施例中，所有GLYMO投料过程保证反应体系温度在0-10℃。本专利技术的实施例中，低温下向APB溶液中缓慢滴加10-150μL的GLYMO，再将反应体系升至20-80℃并保持此温度搅拌反应3-10h。本专利技术的实施例中，同法加入GLYMO继续与APB反应，重复此步骤1-5次得到GLYMO-APB溶液。本专利技术的实施例中，GLYMO水解产生的沉淀由离心或过滤去除，收集上GLYMO-APB溶液，低温储存。本专利技术的实施例中，取20-200mg取磁性石墨烯与0.1-2.0g十六烷基三甲基溴化铵分散在水中，调节pH至弱碱性，30-80℃加热搅拌下加入1.0-6.0mL正硅酸乙酯与乙醇的混合物（体积比0.2-10.0）后继续加热搅拌反应6-18小时，所得无官能团修饰的介孔磁性石墨烯复合材料以丙酮在20-70℃下洗去介孔模板剂CTAB。本专利技术的实施例中，向5-100mLGLYMO-APB溶液中加入5-200mg介孔磁性石墨烯复合材料后在30-80℃下搅拌反应0.5-10h，而后再加入5-100mLGLYMO-APB溶液重复反应步骤1-5次。本专利技术的实施例中，向0.5-5mL牛奶基质中加入1-100mg硼酸修饰的介孔磁性石墨烯复合材料，超声或涡旋或震荡混合0.1-20分钟本专利技术的实施例中，对于吸附了目标分子的材料，通过加入0.1-10mL洗脱溶剂并混合0.1-15分钟进行洗脱。检测结果显示，本专利技术的方法能够对复杂的牛奶基质中痕量氨基糖苷类抗生素进行高选择性的快速提取富集，从而克服传统SPE方法选择性不强，耗时等问题。附图说明图1为硼酸修饰介孔磁性石墨烯复合材料的合成路线图。图2为实施例中硼酸修饰介孔磁性石墨烯复合材料的透射电子显微镜照片图3为实施例中硼酸修饰介孔磁性石墨烯复合材料的氮吸附-脱吸附曲线及孔径分布图。具体实施方式下面的实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是限制本专利技术的范围。实施例1.利用硼酸修饰介孔磁性石墨烯复合材料应用于富集牛奶中的链霉素、双氢链霉素：（1）硼酸修饰介孔磁性石墨烯复合材料的合成：1）将0.30g石墨烯薄片分散到120mL浓硝酸中，60oC下搅拌7小时，处理过后的石墨烯用去离子水清洗至pH呈中性，50oC真空干燥后收集待用；2）于100mL反应釜中加入150mg酸化处理后的石墨烯、1.8g无水乙酸钠、1.0gPEG-20000,150mg柠檬酸三钠、150mg六水合三氯化铁、40mL乙二醇，超声处理2小时，200℃反应12h后无水乙醇洗涤5次，50oC真空干燥后收集待用；3）在1L圆底烧瓶内加入75mg磁性石墨烯、750mg十六烷基三甲基溴化铵、75mL去离子水超声处理30mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测牛奶中残留氨基糖苷类抗生素的前处理方法，其特征在于，其包括步骤：（1）合成3‑缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（GLYMO）‑氨基苯硼酸（APB）：在低温下进行反应投料而后升温反应，将GLYMO上连接APB；（2）合成介孔磁性石墨烯复合材料：将石墨烯均匀分散在浓硝酸中进行酸化处理后，在所得的酸化石墨烯表面通过反应修饰以四氧化三铁微球得到磁性石墨烯，再在其上一步包覆介孔硅；（3）合成硼酸修饰的介孔磁性石墨烯复合材料：向GLYMO‑APB溶液中加入介孔磁性石墨烯复合材料，升温反应完成对材料的硼酸修饰；（4）利用硼酸修饰的介孔磁性石墨烯复合材料提取富集牛奶中的氨基糖苷类抗生素：向粗去蛋白及脂肪的牛奶基质中加入所得的复合材料，混合使目标分子进入材料孔道内壁并与硼酸基团结合，在磁场作用下收集结合了目标分子的材料，再向收集的材料中加入洗脱液将目标分子洗脱下来，洗脱液过滤后直接进行色谱检测。

【技术特征摘要】
1.一种检测牛奶中残留氨基糖苷类抗生素的前处理方法，其特征在于，其包括步骤：（1）合成3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（GLYMO）-氨基苯硼酸（APB）：在低温下进行反应投料而后升温反应，将GLYMO上连接APB；（2）合成介孔磁性石墨烯复合材料：将石墨烯均匀分散在浓硝酸中进行酸化处理后，在所得的酸化石墨烯表面通过反应修饰以四氧化三铁微球得到磁性石墨烯，再在其上一步包覆介孔硅；（3）合成硼酸修饰的介孔磁性石墨烯复合材料：向GLYMO-APB溶液中加入介孔磁性石墨烯复合材料，升温反应完成对材料的硼酸修饰；（4）利用硼酸修饰的介孔磁性石墨烯复合材料提取富集牛奶中的氨基糖苷类抗生素：向粗去蛋白及脂肪的牛奶基质中加入所得的复合材料，混合使目标分子进入材料孔道内壁并与硼酸基团结合，在磁场作用下收集结合了目标分子的材料，再向收集的材料中加入洗脱液将目标分子洗脱下来，洗脱液过滤后直接进行色谱检测。2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述方法中，将10-500mgAPB溶解于10-100mL溶剂中，调节溶液pH至8-10。3.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述方法中，GLYMO投料过程反应体系温度为0-10℃。4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述方法中，低温下向APB溶液中滴加10-150μL的GLYMO，再将反应体系升至20-80℃并搅拌反应3-10h。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李嫣，冯嘉楠，佘晓健，何心莹，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31