用于检测片段化DNA突变的质控品及其制备方法技术

本发明专利技术公开了用于检测片段化DNA基因突变的质控品及其制备方法，包括如下步骤：以突变型基因组DNA或经构建的突变型质粒为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段；将突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与片段化野生型基因组DNA样本混合，制得质控品。该方法优势在于：对突变型DNA片段随机打断，可以根据不同的检测样本，打断出与之相适应的片段长度。另外，该方法操作简单，相比于合成方法，无需对序列两端加酶切位点及保护性碱基。此外，基于该方法制备的质控品，由于突变型DNA片段为随机打断，断点随机，制备的质控品可以更真实地模拟临床样本。

【技术实现步骤摘要】
用于检测片段化DNA突变的质控品及其制备方法
本专利技术涉及临床检验领域，具体涉及一种用于检测片段化DNA突变的质控品及其制备方法。
技术介绍
目前，基因检测技术已被广泛应用于个体化医疗，高通量测序(NGS)技术的出现使基因检测成本大幅下降，其主要特点是能够同时对输入的序列进行大规模平行测序，获得大量短序列的测序结果。高通量测序的基本原理是将待测DNA打断成小片段，经末端修复、连接接头序列、PCR等步骤进行文库构建，最后使用Illumina，IonTorrent等测序仪进行测序。但是随着这一技术的推广应用，不同实验室在应用NGS对基因突变检测的室间质量评价方面仍为空白。因此，急需对不同检测平台的分析性能及检测结果的准确性进行考察。
技术实现思路
基于此，有必要针对无法对基因突变检测的室间质量进行准确性评价的问题，提供一种用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法。一种用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，包括如下步骤：以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段；将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；或以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段前体，将所述突变型DNA片段前体与质粒连接，得到突变型质粒；再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段；将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；或以人目标基因位点为野生型的DNA为模板，经引物扩增，得到野生型DNA片段；将所述野生型DNA片段与质粒连接，构建野生型质粒；再以所述野生型质粒为模板，经定点突变引物扩增，制得突变型质粒；其中，所述定点突变引物含有突变位点；突变型质粒再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段；将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品。该方法可以通过对突变型DNA片段随机打断的步骤的调控，即可满足不同检测样本的需求，也就是说，随机打断时可以根据不同的检测样本，打断出与之相适应的片段长度。另外，该方法操作简单，相比于合成方法，无需对序列两端加酶切位点及保护性碱基。基于该方法制备的质控品，由于突变型DNA片段为随机打断，断点随机，制备的质控品可以更真实地模拟临床样本。而直接PCR扩增或合成得到的DNA片段，其突变位点在片段中的位置都是固定的，不能反映石蜡包埋(FFPE)样本或血浆样本的真实情况；而且片段长度也是一定的。因此，用PCR扩增或合成的DNA片段制备的质控品，无法真实地模拟临床样本。在其中一个实施例中，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.8、SEQIDNO.11～SEQIDNO.18、SEQIDNO.21～SEQIDNO.28、SEQIDNO.31～SEQIDNO.38。在其中一个实施例中，所述定点突变引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9～SEQIDNO.10、SEQIDNO.19～SEQIDNO.20、SEQIDNO.29～SEQIDNO.30。在其中一个实施例中，所述片段化突变型DNA样本的长度为100bp-300bp。在其中一个实施例中，所述突变型基因组DNA为突变细胞株基因组DNA或突变肿瘤组织DNA。在其中一个实施例中，所述含有片段化野生型基因组DNA的样本为健康人血浆样本、经抽提的健康人血浆游离DNA、打断的健康人白细胞基因组DNA或FFPE组织样本DNA中的一种。在其中一个实施例中，所述片段化突变型DNA样本占片段化野生型基因组DNA的样本拷贝数比例为0.01％～50％。在其中一个实施例中，所述片段化突变型DNA样本为点突变DNA、插入突变DNA、缺失突变DNA或基因融合突变DNA中的一种。在其中一个实施例中，所述片段化突变型DNA样本为人EGFR基因第21外显子的L858R突变DNA、人EGFR基因第20外显子的T790M突变DNA、人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1缺失突变DNA或人EML4-ALK基因融合突变DNA中的一种。此外，本专利技术还提供了一种用于检测片段化DNA突变的质控品。一种用于检测片段化DNA突变的质控品，根据本专利技术的任一制备方法获得。该质控品优点在于，质控品断点随机，可以更真实地模拟临床样本。质控品中掺杂不同比例的片段化突变型DNA均可被检测到，检测到的突变比例均与理论突变比例相符。进而说明，该质控品可用于检测片段化DNA样本中基因突变的质量控制。具体实施方式一种用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，包括如下步骤：S1：突变型DNA片段；其中，S1制备得到突变型DNA片段的具体步骤可以通过以下三种方式得到；以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段。或以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段前体，将突变型DNA片段前体与质粒连接，得到突变型质粒。再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段。或以人目标基因位点为野生型位点的DNA为模板，经引物扩增，得到野生型DNA片段。将野生型DNA片段与质粒连接，构建野生型质粒。再以野生型质粒为模板，经定点突变引物扩增，制得突变型质粒；其中，定点突变引物含有突变位点。突变型质粒再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段。S2：将突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品。在S1中，突变型基因组DNA为突变细胞株基因组DNA或突变肿瘤组织DNA。当然可以理解的是，本专利技术的突变型基因组DNA不限于所列举的DNA。在一优选实施方式中，突变型质粒经引物扩增或酶切后，扩增产物还可以经过纯化处理，得到突变型DNA片段，纯化的目的是去除多余引物和杂质。此外，突变型质粒的构建，无需依赖获取特定的突变细胞株，且相对于用基因编辑改造细胞的方法，操作上更简便。在一优选实施方式中，突变型质粒还可以转化细胞，菌株保种，作为制备质控品所需的突变型质粒的稳定来源。重复试验过程中无需反复构建突变型质粒，只需将细胞扩大培养即可实现突变型质粒的供给。在S2中，将突变型DNA片段随机打断；其中，随机打断中的随机是指打断的位点随机，而不是长度随机。在一优选实施方式中，引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.8、SEQIDNO.11～SEQIDNO.18、SEQIDNO.21～SEQIDNO.28、SEQIDNO.31～SEQIDNO.38。当然也可以为能够实现野生型DNA片段扩增的其它引物序列。在一优选实施方式中，定点突变引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9～SEQIDNO.10、SEQIDNO.19～SEQIDNO.20、SEQIDNO.29～SEQIDNO.30，当然也可以为能够实现相关基因定点突变的其它引物序列。定点突变引物是指含相关基因突变位点的引物。在一优选实施方式中，突变型DNA片段或野生型DNA片段的长度为300bp-10000bp；优选地，突变DNA片段或野生型DNA片段的长度为5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段；将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；或以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段前体，将所述突变型DNA片段前体与质粒连接，得到突变型质粒；再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段；将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；或以人目标基因位点为野生型的DNA为模板，经引物扩增，得到野生型DNA片段；将所述野生型DNA片段与质粒连接，构建野生型质粒；再以所述野生型质粒为模板，经定点突变引物扩增，制得突变型质粒；其中，所述定点突变引物含有突变位点；突变型质粒再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段；将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段；将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；或以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段前体，将所述突变型DNA片段前体与质粒连接，得到突变型质粒；再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段；将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；或以人目标基因位点为野生型的DNA为模板，经引物扩增，得到野生型DNA片段；将所述野生型DNA片段与质粒连接，构建野生型质粒；再以所述野生型质粒为模板，经定点突变引物扩增，制得突变型质粒；其中，所述定点突变引物含有突变位点；突变型质粒再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段；将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品。2.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.8、SEQIDNO.11～SEQIDNO.18、SEQIDNO.21～SEQIDNO.28、SEQIDNO.31～SEQIDNO.38。3.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述定点突变引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9～SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国华，林国旻，王萍，
申请(专利权)人：上海格诺生物科技有限公司，格诺思博生物科技南通有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31