一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法技术

本发明专利技术属于微生物领域，公开了一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA；经琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测；末端修复宏基因组DNA，将marker和小样切下，使用连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；连接产物经λ包装提取物包装，EPI300‑T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。本发明专利技术反映在热带雨林这一极端的环境中，微生物及其基因资源极端而丰富，有利于微生物功能基因挖掘与利用。

【技术实现步骤摘要】
一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法
本专利技术属于微生物领域，尤其涉及一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法。
技术介绍
瓜类枯萎病是葫芦科上的一种毁灭性土传病害，普通化学药剂不易防治。瓜类枯萎病的防治主要有农业防治(嫁接和培育抗病品种等)、物理防治、化学防治、生物防治等，目前多以化学药剂防治为主。但由于土传病害中的病原菌掩蔽性较强，化学杀菌剂难以与其直接接触，不能从根本上杀灭病原菌，施用成本高；同时，化学药剂广泛使用所带来的污染环境、破坏生态平衡等一系列副作用已日趋凸显，生产使用正逐步受到限制；此外，长期使用化学药物，病原菌易产生抗药性，久而久之化学药物失去了原有的作用。因此，符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治方法已显得十分重要和迫切。在生物防治进程中，前人筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌、细菌和放线菌，均是基于实验室可纯培养的微生物。然而，环境中只有不到1％的微生物是可用实验室传统纯培养的方法获得，99％以上的微生物是不可纯培养的。土壤微生物种类极其繁多，代谢形式也呈现多样化，其代谢物的化学复杂性和多样性，是筛选抗生素与药物先导化合物的极具潜力的资源库，许多具有独特结构和良好生物活性的微生物代谢产物被相继发现和开发利用，如用于癌症化疗的药物阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、道诺霉素(daunorubicin)和丝裂霉素(mitomycin)等。近10年来，尽管科学家们努力改进筛选方法和测试病原微生物种类，但是基于微生物纯培养技术发现新抗生素药物的成功几率越来越小，且往往会出现重复筛选的现象。热带雨林微生物丰富，与枯萎病菌具有相近的生态位(可解决微生物在土壤环境中的定植问题)。同时，由于高温高湿、酸性重等特性，微生物极端而丰富，可开发成生防资源。然而多数是非培养的。通过构建该环境样品宏基因组文库，并进行后续的筛选。可以避开土传病害隐蔽性强，难以灭杀的问题；化学药物污染环境、破坏生态平衡等问题；病菌抗药性问题等；同时，也避开了微生物分离培养的问题，既能得到可培养微生物基因，也能得到未培养微生物的基因，为微生物资源利用开辟了一个新的途径。综上所述，现有技术存在的问题是：其一、瓜类枯萎病普通化学药剂不易防治。化学杀菌剂难以与其直接接触，不能从根本上杀灭病原菌，施用成本高；同时，化学药剂广泛使用所带来的污染环境、破坏生态平衡等一系列副作用已日趋凸显，生产使用正逐步受到限制；此外，长期使用化学药物，病原菌易产生抗药性，久而久之化学药物失去了原有的作用。其二、筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌、细菌和放线菌，均是基于实验室可纯培养的微生物。而基于微生物纯培养技术发现新抗生素药物的成功几率越来越小，且往往会出现重复筛选的现象。因而，利用热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法构建并筛选宏基因组文库，可以充分地挖掘该极端环境样品中微生物及其基因资源。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法。本专利技术是这样实现的，一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法包括以下步骤：步骤一，采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；步骤二，末端修复宏基因组DNA，胶回收23kb以上的片段，将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTMDNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；步骤三，连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。进一步，所述步骤三中过夜培养，产生了100板，40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。本专利技术的另一目的在于提供一种由所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法构建的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库包含该极端环境下的细菌、真菌、古菌和病毒等微生物基因资源，既包含实验室可纯培养的，也包含不可纯培养的，其微生物及其基因资源极其丰富。以真菌为例，初步检测含包含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7％和15.5％，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4％，担子菌中以伞菌为主，占10.4％，接合菌和壶菌较少。进一步，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。本专利技术的另一目的在于提供一种由所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建的亚克隆表达文库，所述亚克隆表达文库为es142E、es142G和es153G，库容含576个克隆；从es142E中筛选出活性亚克隆unpks-5，与未培养细菌来源的3-oxoacyl-ACPsynthase基因氨基酸序列相似性为84.15％。本专利技术的另一目的在于提供一种由所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建的异源表达体系。进一步，所述异源表达体系利用内生菌株YA-1，表达pepks、unpks基因，实现抗病菌株介导抗病基因表达外源基因联合高效抗病体系。本专利技术的优点及积极效果为：结合ARDRA酶切分型、18SrRNA基因克隆文库和大的插入片段Fosmid文库构建及筛选的方法，对环境样品真菌测序分析以及序列和功能驱动筛选的手段，为分析热带雨林土壤微生物及其基因资源多样性做一个很好的背景铺垫，反映在热带雨林这一极端的环境中，微生物及其基因资源极端而丰富，有利于微生物功能基因的挖掘与利用。本专利技术采集海南五指山和尖峰岭热带雨林土壤样品多份，混合后，提纯并回收合适的DNA(25-48kb)片段，构建宏基因组Fosmid文库，并对文库进行了包括克隆稳定性、插入片段大小和物种多样性等在内的特征分析。其库容30624个Fosmid克隆，平均插入片段36.5kb左右，包含超过1Gb微生物基因信息，无同源序列占87.79％。采用抑菌圈法和牛津杯法以西瓜枯萎病菌为指示菌进行功能初筛和功能复筛，获得有功能的克隆4个：129C、142E、142G和153G。其中，129C和142E的盆栽防治效果均高于50％，分别为63.09％和53.28％，具有较大的生防应用潜力。构建了亚克隆表达文库es142E、es142G和es153G，库容均含576个克隆；筛选出活性亚克隆unpks-5，与未培养细菌来源的3-oxoacyl-ACPsynthase基因氨基酸序列相似性为83.1％。随着测序技术的飞速发展和价格下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，其特征在于，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法包括采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA；经琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测；末端修复宏基因组DNA，将marker和小样切下，使用连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；连接产物经λ包装提取物包装，EPI300‑T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。

【技术特征摘要】
1.一种热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，其特征在于，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法包括采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA；经琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测；末端修复宏基因组DNA，将marker和小样切下，使用连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。2.如权利要求1所述的带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，其特征在于，所述热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法具体包括以下步骤：步骤一，采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；步骤二，末端修复宏基因组DNA，胶回收23kb以上的片段，将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTMDNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；步骤三，连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。3.如权利要求2所述的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库构建方法，其特征在于，所述步骤三中过夜培养，产生了100板，40,000个...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵志祥，严婉荣，肖敏，陈绵才，曾向萍，
申请(专利权)人：海南省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46