一种重组牛血清蛋白成熟肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种重组牛血清蛋白成熟肽，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述重组牛血清蛋白成熟肽的优化核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述重组牛血清蛋白成熟肽制备方法包括：人工合成牛血清蛋白成熟肽的优化基因；然后将该基因整合到表达载体中，并用该载体转化各种宿主细胞进行表达；通过培养已转化的宿主细胞，得到的发酵液中含有大量的重组蛋白；再对发酵液进行分离纯化即得。本发明专利技术的重组牛血清蛋白经质谱检测与天然牛血清蛋白成熟肽序列完全一致，具有免受动物病毒污染，纯度高等优点，是目前为止天然牛血清蛋白最佳替代品，可以广泛应用在生化医药等行业中。

A recombinant bovine serum protein mature peptide and its preparation and Application

The invention belongs to the field of gene engineering, in particular to a recombinant bovine serum protein mature peptide, the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 shows, optimize the nucleotide sequence encoding the recombinant bovine serum protein of mature peptide is shown as SEQ ID NO:3; recombinant bovine serum protein of the mature peptide preparation the method includes: optimization of artificial synthetic gene of bovine serum protein of mature peptide; then the gene into the expression vector, and the vector was transformed into a variety of host cells by expression; culture has transformed host cell containing the recombinant protein of the fermented liquid in the fermentation liquid; separation and purification to obtain. Recombinant bovine serum protein of the present invention by mass spectrometric detection of bovine serum protein and natural mature peptide sequence is completely consistent, from animal viral contamination, purity is high, is by far the best substitute of natural bovine serum protein, can be widely used in biochemical pharmaceutical industry.

【技术实现步骤摘要】
一种重组牛血清蛋白成熟肽及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种重组牛血清蛋白成熟肽及其制备方法和应用。
技术介绍
牛血清蛋白是牛血清中的主要蛋白，它可与多种阳离子、阴离子以及其他小分子物质结合。在血液中，牛血清蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用以及营养作用。在体外，牛血清蛋白在生化实验中有着广泛的应用，例如用作各种限制酶或修饰酶的稳定剂，免疫组化、酶联免疫吸附法等免疫反应的封闭剂，以及用作动物细胞培养基成分之一。其中，牛血清蛋白作为限制酶或修饰酶稳定剂，有着巨大的市场。近年来，由于受到疯牛病等病毒的威胁，人们对于动物来源制品的要求也越来越高。传统从牛血液中提取制备牛血清蛋白的方法，虽然通过后续各种检测方法能检测出已知病毒等污染物，但对于未知的病毒，显得无能为力。而且一旦检测出疯牛病等病毒污染，通过这种耗时耗力的方法获得的牛血清蛋白就要被销毁掉，这无疑是一种巨大的浪费。目前市场上销售的无动物病毒的牛血清蛋白很少，主要是新英格兰公司(NEB)开发的重组牛血清蛋白，但是上述重组蛋白与天然牛血清蛋白的成熟肽序列相比，在N端多出6个氨基酸残基，由于蛋白质的N端对蛋白质的生物活性有着非常重要的作用，这种差异在一定程度上会造成其与天然蛋白之间产生巨大的功能差异，并进一步限制其应用。由此可见，现有技术还存在较大缺陷。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种更接近天然牛血清蛋白的成熟肽的重组牛血清蛋白成熟肽及其制备方法和应用；本专利技术的重组牛血清蛋白经质谱检测与天然牛血清蛋白成熟肽序列完全一致，具有免受动物病毒污染，纯度高等优点，是目前为止天然牛血清蛋白最佳替代品，可以广泛应用在生化医药等行业中。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种重组牛血清蛋白成熟肽，其氨基酸残基序列如SEQIDNO：1所示。一种重组牛血清蛋白成熟肽，编码所述重组牛血清白蛋白成熟肽的优化核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。进一步的，所述优化的核苷酸序列是按照表达宿主密码子偏好性进行密码子优化。进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽的氨基序列与自然型牛血清白蛋白成熟肽氨基酸序列具有100％相似性。一种重组牛血清蛋白成熟肽的制备方法，操作方法包括：(1)人工合成上述牛血清蛋白成熟肽的优化核苷酸序列；(2)将(1)中合成基因整合到表达载体中，并用该载体转化宿主细胞进行表达；(3)通过培养(2)中已转化的宿主细胞，得到的发酵液中含有大量的重组蛋白；(4)对(3)中所得发酵液进行分离纯化，获得高纯度的重组牛血清蛋白成熟肽。进一步的，步骤(2)中所述宿主细胞为食品级酵母。进一步的，所述酵母包括克鲁维酵母细胞、酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母或毕赤酵母中的一种。进一步的，步骤(4)中所述分离纯化方法采用离子交换层析法。进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽或所述方法制得的牛血清白蛋白成熟肽应用于制备医药保健食品、其他酶类的保护剂或调味品等；维持渗透压、pH缓冲、载体作用。进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽或所述方法制得的牛血清白蛋白成熟肽应用于β-葡聚糖酶的热稳定剂。进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽或所述方法制得的牛血清白蛋白成熟肽的终浓度为：0.2％-1％。进一步的，所述重组牛血清蛋白成熟肽或所述方法制得的牛血清白蛋白成熟肽的终浓度为1％。本专利技术有益效果：本专利技术通过人工合成牛血清蛋白成熟肽基因，按照宿主密码子偏好性进行密码子优化，有利于BSA在宿主中进行高效表达；然后将该基因整合到表达载体中，并用该载体转化宿主细胞进行表达，再通过培养已转化的宿主细胞，得到的发酵液中含有大量的重组蛋白；然后采用离子交换层析对发酵液进行分离纯化，获得高纯度的重组牛血清蛋白成熟肽。这种方法易于工业化生产，全程操作易控，特别是对于病毒、细菌或其他因素所带来的污染，能得到有效控制甚至完全避免。且所获得的重组牛血清蛋白经质谱检测与天然牛血清蛋白成熟肽序列完全一致，具有免受动物病毒污染，纯度高等优点，是目前为止天然牛血清蛋白最佳替代品，可以广泛应用在生化医药等行业中。酵母已成为世界上研究最多的微生物之一，是当今生物技术产品研究开发的热点和现代生物技术发展、基因组研究的模式系统。科学证明，酵母菌作为宿主细胞有利于机遇难得多次复制。克鲁维酵母是一般认为安全(GRAS，GenerallyRecognizedasSafe，FDA认证)的菌株之一，利用基因工程的方法大规模分泌表达牛血清蛋白成熟肽，目的蛋白可以占到上清总蛋白的80％以上，利用这种方法获取具牛血清蛋白成熟肽有明显的优势。所获得的重组蛋白在生化医学等领域具有多种用途，具有免受动物病毒污染，纯度高，成本低等优点。附图说明图1、重组pKLAC1-BSA物理图谱。图2、含有重组牛血清蛋白成熟肽基因片段的核苷酸电泳：1、2泳道分别是分子量标准和BSA扩增产物。图3、含有牛血清蛋白成熟肽基因的重组克鲁维酵母发酵上清SDS-PAGE：泳道1为Marker，泳道2为β-乳球蛋白阳性对照，泳道3为重组牛血清蛋白成熟肽，泳道4为空白对照。图4、BSA1和BSA2为纯化后的牛血清蛋白电泳图图5、重组牛血清蛋白作为β-葡聚糖酶的热稳定剂应用效果检测结果。图6、重组牛血清蛋白成熟肽Western-blot：第一泳道为天然牛血清蛋白标准品(S1)，第二泳道为重组牛血清蛋白成熟肽(S2)，第三泳道为空白对照。图7、重组牛血清蛋白质谱鉴定报告英文版；鉴定结果为天然的牛血清蛋白。图8、重组牛血清蛋白质谱鉴定报告中文版；鉴定结果为天然的牛血清蛋白具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1重组牛血清蛋白成熟肽的表达根据NCBI公布的牛血清蛋白成熟肽的氨基酸序列(NCBI登录号：NP_851335)，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；利用OptimumGene按照宿主密码子偏好性对其对应的碱基序列SEQIDNo.2进行优化，优化位点多达200多处，优化之后的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，SEQIDNo.3所示的序列更有利于牛血清蛋白在异源宿主克鲁维酵母的高效表达，并正确折叠包装。委托金斯瑞生物科技有限公司人工合成优化后的牛血清蛋白的成熟肽基因序列。对合成的基因用引入XhoI和NotI两端酶切位点，引入位点所用的引物为：bsa-F:CCGCTCGAGGACACTCACAAGTCTGAAAT；bsa-R:TTGCGGCCGCTTAAGCCAAAGCAGTTTGAGTAG；扩增产物电泳显示泳道2在1700bp处有明显亮带(如图2)，获得的基因片段采用XhoI和NotI酶切，然后引入pKLAC1质粒(购于NEB公司)中，得到的重组质粒命名为pKLAC1-BSA(图1)，经酶切及测序检测(英潍捷基生物公司)，序列正确(如SEQIDNo.4)。酶切体系(50μL)：限制性内切酶共2μL，酶切缓冲液5μL，质粒＜1μg，剩余体积用水补齐。连接体系(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组牛血清蛋白成熟肽，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组牛血清蛋白成熟肽，其氨基酸残基序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的重组牛血清蛋白成熟肽，其特征在于，编码所述重组牛血清白蛋白成熟肽的优化核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。3.根据权利要求1所述的重组牛血清蛋白成熟肽，其特征在于，所述重组牛血清蛋白成熟肽的氨基序列与自然型牛血清蛋白成熟肽氨基酸序列具有100％相似性。4.一种重组牛血清蛋白成熟肽的制备方法，操作方法包括：(1)人工合成权利要求2所述的牛血清蛋白成熟肽的优化核苷酸序列；(2)将(1)中合成核苷酸序列整合到表达载体中，并用该载体转化宿主细胞进行表达；(3)通过培养(2)中已转化的宿主细胞，得到含有大量的重组蛋白的发酵液；(4)对(3)中所得发酵液进行分离纯化，获得高纯度的重组牛血清蛋白成熟肽。5.根据权利要求4所述的重组牛血清蛋白成熟肽的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔金明，李小明，张齐，刘陈立，蒙海林，黄建东，
申请(专利权)人：广州中国科学院先进技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44