蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用技术

本发明专利技术公开了一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用。制备方法包括（1）能够特异性识别MRJP1蛋白的多克隆抗体SP‑1和SP‑2的制备和纯化；（2）胶体金溶液的制备；（3）硝酸纤维素膜上包被质控线（C线）和检测线（T线）；（4）以蜜蜂内源性蛋白MRJP1为标志物的蜂蜜双抗体夹心快速检测试纸条的组装；（5）蜂蜜检测样品的准备。从蜂蜜样品中分离纯化的蛋白与该金标试纸条反应后，根据T线是否显色可以判别蜂蜜样品的真伪。本发明专利技术的蜂蜜双抗体金标试纸条适用于人造糖浆冒充的假蜂蜜的检测，为蜂蜜质量及掺假检测提供了一种非常可靠的快速检测新方法。

Preparation method of fast test paper for honey detection and its test paper and Application

The invention discloses a preparation method of a fast test paper for honey detection and its test paper strip and its application. The preparation method comprises (1) can specifically recognize MRJP1 protein polyclonal antibody SP 1 and SP 2 preparation and purification; (2) colloidal gold solution is prepared; (3) coated on the cellulose nitrate film quality control line (C line) and test line (T line) (; 4) assembly to bee endogenous protein MRJP1 as a marker of honey sandwich test strip for rapid detection of honey; (5) testing sample preparation. The true and false of the honey sample can be judged according to the color of the T line after the reaction of the purified protein from the honey sample and the gold mark test paper. The honey double antibody gold standard test strip is suitable for the detection of fake honey by artificial syrup, which provides a very reliable and fast detection method for honey quality and adulteration detection.

【技术实现步骤摘要】
蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用
本专利技术涉及一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法及其试纸条与应用。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂釆集植物的花蜜、分泌物或蜜露与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。作为营养丰富的天然甜味剂和保健品，蜂蜜深受全球消费喜爱，但它却是一种极易被掺假的食品。近些年来蜂蜜掺假愈演愈烈，掺假越来越不容易被识别，已严重扰乱蜂蜜市场秩序。中国蜂产品协会公布的2014年网售蜂蜜抽检结果显示，在淘宝、天猫和京东商城销量领先的20款蜂蜜中，有13款产品掺假，导致产品信任危机，行业整体价格和效益下降，对蜂蜜产业的健康发展造成严重影响。以前蜂蜜掺假的主要方式是在蜂蜜中加入水、糖、羧甲基纤维素、糊精或淀粉类物质，这些掺假蜂蜜可以通过简单的感官品评和化学反应方法识别出来，也可以通过现代分析检测技术对其进行判别，所以这些掺假手段现已不常见。目前市场上最常见的蜂蜜掺假方式是在蜂蜜中加入果葡糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆等，尤其是用大米糖浆勾兑的假蜂蜜，其理化指标和风味完全可以通过欧盟标准，蜂蜜中的果糖和葡萄糖比例与掺入糖浆的成分比例十分相似，难以检测，严重影响了我国国际贸易声誉。2015年3月，在十二届全国人大三次会议上，10名全国人大代表提交了“严厉打击假劣蜂产品的建议”的提案。2015年7月，国家食品药品监督管理总局在其官网正式作出回应：我国现行蜂蜜国家标准无法鉴别蜂蜜的真假，将积极推动蜂蜜食品安全国家标准的修订和蜂蜜掺假补充检验方法的建立。为解决掺假蜂蜜的检测技术问题，国内外已开展了大量研究探索。已有报道的理化检测方法分为以下几类：（一）传统方法（1）常规理化指标检测。通过水分、糖分、酸度、灰分等的检测判定蜂蜜质量[丁梅，吴鸣，辛若竹，何逸伟，闫吉昌.利用常规检测指标鉴定蜂蜜质量的研究.中国食物与营养.2009，(10):.40-43.]。这些检测可以针对较为“低级”的掺水、掺糖方式进行监控，但造假者很容易通过适当调配而使掺假蜂蜜的理化指标达到标准要求，随着造假技术的提高，已不能达到鉴别蜂蜜真假的目的。（2）花粉鉴别。用显微技术对蜂蜜样中的花粉进行形态识别，从而对蜂蜜掺假进行鉴定[Lutier，PM，VaissiereBE.Animprovedmethodforpollenanalysisofhoney.ReviewofPalaeobotanyandPalynology.1993.78:129-144]，由于受采蜜方式、蜜源等因素影响，存在很多不确定性，制假者也很容易通过添加花粉的规避。（二）理化方法（1）稳定性碳同位素比率法。其依据是所有蜜源植物都属于C3植物，甜菜、大米属于C3植物，玉米、甘蔗等属于C4植物。为此《蜂蜜》行业标准（GH/T18796-2012）要求采用GB/T18932.1-2002规定的“元素分析-同位素比值质谱法”对蜂蜜真实性进行鉴定，以检测掺入蜂蜜中的C4植物糖含量。有报道表明，采用液相色谱-同位素比率质谱联用仪（LC-IRMS）可检出C3糖（甜菜糖）和C4糖（蔗糖、蔗糖糖浆、高果玉米糖浆）；采用液相色谱/元素分析-同位素比值质谱联用法（LC/EA-IRMS）可检出多种掺入C3糖浆和C4糖浆的假蜂蜜[FeiX，WuB，ShenCY，DingT，LiLH，LuY.Honeyadulterationdetectionusingliquidchromatography/elementalanalysis-isotoperatiomassspectrometry.ChineseJournalofChromatography，2011，(1):15-19]。（2）高效液相色谱法。根据蜂蜜和高果糖浆中高寡糖的不同，采用该法检测检测蜂蜜中是否掺有C4植物高果糖浆、C3植物高果糖浆，检测灵敏度可达2.5%[张存洁，董伟，曾纪琰.高效液相色谱法检测蜂蜜中高果糖浆掺假.食品科学，1993，158(2):71-75]。（3）光谱技术鉴别。如近红外光谱分析（NIR）法，通过NIR与DPLS化学计量学方法结合建立数学模型，以C4植物糖检测结果为判定依据，快速识别掺入蜂蜜的甜菜糖浆和高果玉米糖浆[ZhangYL，ChenLZ，XueXF，WuLM，LiYu，YangJ.DiscriminationofricesyrupadulterantofAcaciahoneybasedusingnear-infraredspectroscopy.SpectroscopyandSpectralAnalysis，2015.35(9):2536-2539.]用拉曼光谱结合化学计量学方法，建立PLS-LDA模型，预测掺入蜂蜜中的甜菜糖浆含量。（4）核磁共振法（NMR）鉴别法。用一维和二维核磁共振法，结合多变量统计分析，检测蜂蜜中掺入不同浓度的糖浆[Liu，JP，HuLQ，CaiYL，YinCL.Progressontheidentificationofhoneytypeandadulteratedhoneyabroad.JournalofHenanUniversityofTechnology-NaturalScienceEdition，2011，(4):87-94.]。（5）元素组成分析法。如用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS结合主成分分析和判别分析，通过测定洋槐蜜、葵花蜜和油菜蜜中各种矿物质元素含量的方法，建立判别模型；也有根据掺假大米糖浆砷的含量高于纯正蜂蜜的差别，通过ICP-MS法检测进行检测[WuZB，ChenF，ChenLZ，ZhaoJ，LiY，WuLM，YeZH.Applicationofinductivelycoupledplasmamassspectrometrywithchemometricmethodsinclassificationofhoneysaccordingtotheirtypes.SpectroscopyandSpectralAnalysis，2015，(1):217-222.]。（6）其他方法。如基于羟甲基糠醛的检测法，用糖浆制作过程中产生羟甲基糠醛作为鉴别指标。由于新鲜天然蜂蜜中不含羟甲基糠醛，通过液相色谱紫外检测法和分光光度法可对蜂蜜中是否含有羟甲基糠醛进行检测，以此来作为蜂蜜品质评价的依据[ZappalaA，FallicoB，ArenaE，VerzeraA.MethodsforthedeterminationofHMFinhoney:acomparison.FoodControl，2005，16(3):273-277.]。（三）指纹图谱检测方法该方法是利用色谱、光谱、电子鼻等技术手段采集多种特征性指标，整合产地、蜜源等信息，运用正交偏最小二乘-逐级聚类(OPLS-HCA)等方法进行数据分析和挖掘，建立一套数学模型用于后续的判断。此类方法通常用于蜂蜜的产地、蜜源的溯源研究。由于气候、环境条件、加工、贮藏、运输过程的影响，蜂蜜特征性指标会经常改变，需要反复建立模型，工作量大。另外，由多种蜜源的蜂蜜组成的百花蜜其组分变化大，难以建立对应的数学模型，模型适用性不大[CaoW，ZhengJB.ApplicationoftheHPLCfingerprintsinhon本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤如下：1）针对MRJP1的多克隆抗体SP‑1和SP‑2的制备和纯化：1.1通过对MRJPs蛋白家族氨基酸序列作同源性分析，筛选出MRJP1不同于其他家族成员的氨基酸序列：分别位于MRJP1第56‑70位的寡肽1‑SGEYDYKNNYPSDID，第360‑372位的寡肽2‑ IKEALPHVPIFD，即分别为抗体SP‑1和SP‑2所对应的抗原多肽；1.2根据寡肽1和寡肽2的氨基酸序列，进行化学合成，将多肽与KLH偶联，作为免疫抗原；1.3分别将2个免疫抗原与缓冲液和佐剂混合，在第1d、15d、29d、43d分别多点注射新西兰大白兔2只；1.4第53 d，颈动脉取血，收集血清，通过抗原亲和柱纯化、透析，分别得到MRJP1的特异性抗体SP1和SP2；2）胶体金溶液的制备：取氯金酸水溶液制备成含有粒径为20‑40 nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；3）胶体金标记抗体：取SP‑1抗体加入到胶体金溶液中，制备成免疫胶体金溶；4）在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被商用羊抗兔lgG，T线为检测线，包被上述步骤1）制得的SP‑2抗体；用划膜机点在硝酸纤维素膜上即得C线和T线，使C线和T线相距5 mm；室温晾干，得到包被后的硝酸纤维素膜；5）胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将样品垫、上述步骤4）所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水垫一次粘贴到聚氯乙烯（PVC）底板上，切割成2~3 mm宽的条状，即得快速检测试纸条；4℃避光干燥保存。...

【技术特征摘要】
1.一种蜂蜜快速检测试纸条的制备方法，其特征在于，步骤如下：1）针对MRJP1的多克隆抗体SP-1和SP-2的制备和纯化：1.1通过对MRJPs蛋白家族氨基酸序列作同源性分析，筛选出MRJP1不同于其他家族成员的氨基酸序列：分别位于MRJP1第56-70位的寡肽1-SGEYDYKNNYPSDID，第360-372位的寡肽2-IKEALPHVPIFD，即分别为抗体SP-1和SP-2所对应的抗原多肽；1.2根据寡肽1和寡肽2的氨基酸序列，进行化学合成，将多肽与KLH偶联，作为免疫抗原；1.3分别将2个免疫抗原与缓冲液和佐剂混合，在第1d、15d、29d、43d分别多点注射新西兰大白兔2只；1.4第53d，颈动脉取血，收集血清，通过抗原亲和柱纯化、透析，分别得到MRJP1的特异性抗体SP1和SP2；2）胶体金溶液的制备：取氯金酸水溶液制备成含有粒径为20-40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；3）胶体金标记抗体：取SP-1抗体加入到胶体金溶液中，制备成免疫胶体金溶；4）在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线为质控线，包被商用羊抗兔lgG，T线为检测线，包被上述步骤1）制得的SP-2抗体；用划膜机点在硝酸纤维素膜上即得C线和T线，使C线和T线相距5mm；室温晾干，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈立荣，张一帆，辛晓璇，蒋晨旻，王一然，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33