无刺蜂蜂蜜多酚物质的提取及其在免疫调节中的应用制造技术

本发明专利技术提出一种无刺蜂蜂蜜多酚物质的提取方法，包括步骤：1)无刺蜂蜂蜜用醋酸水溶液溶解，经过搅拌和超声处理后，过滤，分离出无刺蜂蜂蜜水溶液；2)将大孔树脂倒入无刺蜂蜂蜜水溶液中，搅拌吸附0.5～2h；3)将吸附后的大孔树脂填入柱中，分别用醋酸水溶液、纯水淋洗，最后用乙醇溶液洗脱，4)洗脱液减压真空浓缩至成为固形物，复溶于纯水，并用乙酸乙酯萃取。本发明专利技术通过XAD‑2柱层析提取富集无刺蜂蜂蜜有效成分，进行了无刺蜂蜂蜜提取物的成分分析、应用研究，发现无刺蜂蜂蜜提取物具有丰富的黄酮、多酚类活性成分，具有显著的抗氧化、抗炎活性，对于预防和治疗炎症疾病药物、食品、保健品的开发和应用具有广泛的应用价值。

Extraction of honey polyphenols from spiny bee and its application in immunomodulating

The invention provides a method for extracting, stingless bee honey polyphenol comprises the following steps: 1) stingless bee honey dissolved in aqueous solution of acetic acid, after stirring and ultrasonic treatment, filtration, separation of stingless bee honey water solution; 2) Kong Shuzhi will pour stingless bee honey water solution, stirring adsorption 0.5 ~ 2H; 3) the macroporous resin adsorption column after filling, respectively with acetic acid solution, water leaching, finally ethanol eluted, eluent 4) vacuum concentration to become complex solids, insoluble in pure water, and extracted with ethyl acetate. The XAD 2 column chromatography extraction and enrichment of stingless bee honey effective ingredients, the application research and analysis, the composition of the extract of honey bees, stingless bee honey extract has found that flavonoids and polyphenol rich active ingredients, has significant antioxidant and anti-inflammatory activity, and has wide application value for the development and application of drug for prevention and treatment of inflammatory diseases, food, health care products.

【技术实现步骤摘要】
无刺蜂蜂蜜多酚物质的提取及其在免疫调节中的应用
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及一种蜂蜜的提取方法和提取产物。
技术介绍
无刺蜂(Stinglessbees)是一类营群体生活并能酿蜜的昆虫，隶属于膜翅目(Hymenoptera)、蜜蜂总科(Apoidea)、蜜蜂科(Apidae)，蜜蜂亚科(Apinae)，麦蜂族(MeliPonini)，无刺蜂属(TrigonaJurine)，体呈黑色，体小灵活，是热带地区植物的主要传粉蜂种，主要分布于热带和亚热带地区，我国仅在云南、海南和台湾地区的田间森林有分布。无刺蜂蜂蜜是无刺蜂从植物蜜腺或其他部位采来的花蜜，经充分酿造，存储于巢房的甜蜜物质，与西方蜜蜂蜂蜜相比，具有水分含量高、酸度高、酶值低、粘度低等特点。蜂蜜早已被人们作为一种天然的甜味剂，由于其存在的活性成分，也被广泛应用于临床实践。已有报道证明蜂蜜具有多种生物活性，而对无刺蜂蜂蜜的活性成分的提取和分离研究进行的还比较少。无刺蜂蜂蜜含有丰富的营养物质和生物活性成分，世界范围内，主要产自秘鲁、瓜地马拉、墨西哥、委内瑞拉等国家。Meliponaspp，Scaptotrigonaspp，Trigonaspp等无刺蜂属蜂蜜已广泛应用于传统医学，具有显著的抗氧化、抗菌、抗突变、促进伤口愈合等生物活性功能。无刺蜂蜂蜜的化学成分复杂，尤其是其主要活性成分酚酸黄酮类物质，因蜂种、采集植物、地理环境、气候、季节的变化而导致无刺蜂蜂蜜成分、活性的差异。我国已发现的无刺蜂蜂种有黄纹无刺蜂(TrigonaventralisSmith)、顶无刺蜂(T.terminateSmith)、暗翅无刺蜂(T.viduaLepeletier)、蜜色无刺蜂(T.luteaBingham)、黑胸无刺蜂(T.pagdeniSehwarz)、棕足无刺蜂(T.smithiiSmith)、棕胸无刺蜂(T.thoracicaSmith)、黑腿无刺蜂(T.viduaSmith)、黑腹无刺蜂(T.canifronsSmith)、黄跗无刺蜂(T.iridipennisSmith)，其中以黄纹无刺蜂分布最广、数量最多。但无有关我国无刺蜂蜂蜜成分和活性的研究报道。
技术实现思路
针对本领域的不足之处，本专利技术的目的是提供一种无刺蜂蜂蜜的提取方法。本专利技术的另一目的是提出所述提取方法获得的提取物。本专利技术的第三个目的是提出所述提取物的应用。实现本专利技术上述目的的技术方案为：一种无刺蜂蜂蜜多酚物质的提取方法，包括步骤：1)无刺蜂蜂蜜用醋酸水溶液溶解，经过搅拌和超声处理后，过滤，分离出无刺蜂蜂蜜水溶液；2)将大孔树脂倒入无刺蜂蜂蜜水溶液中，搅拌吸附0.5～2h；3)将吸附后的大孔树脂填入柱中，分别用醋酸水溶液、纯水淋洗(以除去极性物质，糖等)，最后用乙醇溶液洗脱并收集洗脱液，4)洗脱液减压真空浓缩至成为固形物，复溶于纯水，并用乙酸乙酯萃取。收集乙酸乙酯层，氮气吹干，得无刺蜂蜂蜜提取物。该提取物放置于-20℃冰箱中备用。本提取方法可针对黄纹无刺蜂的蜂蜜但不限于此。进一步地，步骤1)中所述醋酸水溶液的pH值为1.8～2.5,无刺蜂蜂蜜和醋酸水溶液的质量体积比为8g：20～60mL；所述超声的时间为20～40min，所述过滤的过滤介质为棉花、滤纸、滤膜中的一种。优选地，步骤2)中所述大孔树脂为AmberliteXAD-2大孔树脂，大孔树脂和无刺蜂蜂蜜的质量比例为1：0.5～2，所述大孔树脂首先经乙醇浸泡活化，然后用于吸附。其中，步骤3)中所述醋酸水溶液的pH值为1.8～2.5,无刺蜂蜂蜜和醋酸水溶液、纯水的质量体积比为8g：10～20mL：20～30mL。其中，步骤3)中无刺蜂蜂蜜和无水乙醇溶液的质量体积比为8g：50～80mL；步骤4)中减压真空浓缩的温度为30～50℃。其中，步骤4)中水箱和有机相的体积比为1：2～6。所述的提取方法，还包括对步骤4)得到的无刺蜂蜂蜜提取物进行液相色谱-串联质谱联用分离的操作，色谱条件：采用十八烷基硅烷色谱柱，流动相为纯水-甲醇；流速0.2mL/min；进样量2μL；柱温30℃；洗脱梯度为0-2min，5％；2-10min，15％-30％；10-25min，30％-90％；25-30min，90％；30-31min，15％；质谱条件：ESI源，载气温度(GasTemp)：350℃，干燥气流速(DryingGas):11L/min，雾化气压(Nebulizer)：40psig。本专利技术所述提取方法得到的无刺蜂蜂蜜提取物。所述的无刺蜂蜂蜜提取物在免疫调节中的应用。优选地，所述的无刺蜂蜂蜜提取物在制备抗炎症药物中的应用。本专利技术提出的方法，实现了对无刺蜂蜂蜜中多酚物质的提取，每100g无刺蜂蜂蜜可得固形物0.1519g，试验证明该提取物具有免疫调节功能。本专利技术通过XAD-2柱层析提取富集无刺蜂蜂蜜有效成分，进行了无刺蜂蜂蜜提取物的成分分析、应用研究，发现无刺蜂蜂蜜提取物具有丰富的黄酮、多酚类活性成分，具有显著的抗氧化、抗炎活性，对于预防和治疗炎症疾病药物、食品、保健品的开发和应用具有广泛的应用价值。本实验通过XAD-2柱层析法富集了我国海南无刺蜂蜂蜜中的多酚类有效活性成分，利用液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(Q-TOF-LC/MS)法测定其多酚化学成分，研究了我国无刺蜂蜂蜜多酚提取物的体外抗氧化活性(DPPH、ABTS的自由基清除、总还原力)及对细菌脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞体外炎症反应的调节作用，探讨无刺蜂蜂蜜的抗炎、抗氧化作用及其可能的机制，为我国无刺蜂蜂蜜的开发利用提供理论依据。附图说明图1：SBH对Raw264.7细胞释放NO能力及相关炎症基因mRNA水平表达的影响。具体实施方式现以以下实施例来说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。说明书中使用的手段，如无特别说明，均为本领域常规的技术手段。实施例1：称取800g无刺蜂(海南，黄纹无刺蜂,TrigonaventralisSwith)蜂蜜，用4L醋酸(pH2.0)水溶解，搅拌溶解后超声30min，棉花过滤，待用。AmberliteXAD-2大孔树脂经乙醇浸泡24h后，称取800g活化大孔树脂，水洗2-3遍至无味，倒入无刺蜂蜂蜜水溶液中，搅拌吸附1h。静置，弃去上清液，并将大孔树脂填入玻璃柱中，分别用1.6LpH2的醋酸水溶液、2.4L纯水淋洗以除去糖等极性物质，最后用6.4L无水乙醇溶液洗脱并收集洗脱液，40℃减压真空浓缩至固形物，共1.2152g，复溶于10mL纯水，并用40mL乙酸乙酯萃取。收集乙酸乙酯层，氮气吹干，所得无刺蜂蜂蜜提取物(SBH)为0.552g，放置于-20℃冰箱中备用。高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(6510Q-TOFLC/MS)，安捷伦科技有限公司，进行液质联用分析，色谱条件：采用proshell120SB-C18色谱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)，流动相为纯水(A)-甲醇(B)；流速0.2mL/min；进样量2μL；柱温30℃；洗脱梯度为0-2min，5％；2-10min，15％-30％；10-25min，30％-90％；25-30min，90％；30-31min，15％。质谱条件：ESI源，载气温度(GasTemp)：350℃，干燥气流速(DryingGa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无刺蜂蜂蜜多酚物质的提取方法，其特征在于，包括步骤：1)无刺蜂蜂蜜用醋酸水溶液溶解，经过搅拌和超声处理后，过滤，分离出无刺蜂蜂蜜水溶液；2)将大孔树脂倒入无刺蜂蜂蜜水溶液中，搅拌吸附0.5～2h；3)将吸附后的大孔树脂填入柱中，分别用醋酸水溶液、纯水淋洗，最后用乙醇溶液洗脱并收集洗脱液，4)洗脱液减压真空浓缩至成为固形物，复溶于纯水，并用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，氮气吹干，得无刺蜂蜂蜜提取物。

【技术特征摘要】
1.一种无刺蜂蜂蜜多酚物质的提取方法，其特征在于，包括步骤：1)无刺蜂蜂蜜用醋酸水溶液溶解，经过搅拌和超声处理后，过滤，分离出无刺蜂蜂蜜水溶液；2)将大孔树脂倒入无刺蜂蜂蜜水溶液中，搅拌吸附0.5～2h；3)将吸附后的大孔树脂填入柱中，分别用醋酸水溶液、纯水淋洗，最后用乙醇溶液洗脱并收集洗脱液，4)洗脱液减压真空浓缩至成为固形物，复溶于纯水，并用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，氮气吹干，得无刺蜂蜂蜜提取物。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中所述醋酸水溶液的pH值为1.8～2.5,无刺蜂蜂蜜和醋酸水溶液的质量体积比为8g：20～60mL；所述超声的时间为20～40min，所述过滤的过滤介质为棉花、滤纸、滤膜中的一种。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中所述大孔树脂为AmberliteXAD-2大孔树脂，大孔树脂和无刺蜂蜂蜜的质量比例为1：0.5～2，所述大孔树脂首先经乙醇浸泡活化，然后用于吸附。4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤3)中所述醋酸水溶液的pH值为1.8～2.5,无刺蜂蜂蜜和醋酸水溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凯，梁馨文，王亮，吴黎明，薛晓锋，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11