用于刺激细胞增殖和提供 FGF2 同种型的生物活性混合物的方法和组合物技术

本文公开了用于提供具有生物活性的FGF2同种型的混合物的方法和组合物。生物活性包括但不限于刺激神经前体细胞的增殖，刺激内皮细胞的增殖，刺激神经前体细胞的发育和刺激星形胶质细胞的发育。

Methods and compositions for stimulating cell proliferation and providing a bioactive mixture of FGF2 homotype

This article discloses a method and a composition for providing a mixture of FGF2 homotype with biological activity. Bioactivity includes, but is not limited to, stimulating the proliferation of neural precursor cells, stimulating the proliferation of endothelial cells, stimulating the development of neural precursor cells and stimulating the development of astrocytes.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于刺激细胞增殖和提供FGF2同种型的生物活性混合物的方法和组合物相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求美国临时专利申请号62/178,190(2015年4月1日提交)和美国临时专利申请号62/204,776(2015年8月13日提交)的权益；为了所有目的，其公开内容通过引用整体并入本文。关于联邦政府支持的声明不适用。领域本专利技术涉及生长因子及其对细胞特别是神经细胞和与神经系统相关的细胞的增殖和发育的影响的领域。背景间充质细胞植入间充质基质细胞(MSC)及其衍生物的植入正在被作为中枢神经系统(CNS)的各种退行性疾病的治疗进行开发。认为MSC植入CNS导致的治疗效果主要是由于来自活的植入细胞的可溶性因子的分泌，所述可溶性因子提供组织保护、再生和免疫调节刺激[1-3]。然而，矛盾的是，植入后CNS中MSC的移植率较低[4,5]；并且已经观察到治疗益处在移植细胞不能被检测到之后持续很长时间。已经提出了各种解释来解释植入的MSC的不良移植。一些研究者提出触发先天和随后的适应性免疫应答来解释移植物损失；然而，其他人发现与HLA匹配状态无关的相似移植细胞丢失率[6,7]。另外的研究提供了证据，显示同种异体MSC在植入后不会引起显著的免疫反应(在[8]中综述)。还已经报道，植入成人脑中的细胞内标记的MSC(活的或死的)可以将标签转移到受者的周围和远处的细胞，并且标签可以掺入受者的细胞[9,10]。FGF-2FGF2(也称为碱性成纤维细胞生长因子或bFGF)是干细胞的主要生长因子，血管生成的强力诱导剂，必需的伤口愈合介导因子，和神经系统发育和再生的主要参与者(在[11]中综述)。通过可变翻译起始从独特的FGF2mRNA翻译5个FGF2同种型：18kD低分子量(LMW)同种型；和分子量为22、22.5、24和34kD的高分子量(HMW)同种型。LMWFGF2主要是细胞质的并且是分泌性的，而HMW同种型主要是细胞核的，然而在某些条件下可以在细胞核、细胞质或细胞外基质中发现任何一种异构体。所有同种型缺乏引导通过内质网-高尔基体途径分泌的信号肽。早期研究表明，机械损伤的内皮细胞单层释放高水平的FGF2[12,13]。基于这些研究和分泌信号肽的缺乏，细胞死亡或甚至亚致死性损伤已被描述为FGF2释放的主要机制[14]。因此，FGF2已经被提名为“用于快速引发组织完整性和/或损伤后修复的常规维持所需的细胞生长的伤口激素”[15]。虽然许多报告记录了MSC的FGF2mRNA的表达，并证明细胞内FGF2蛋白的存在[11,12,16]，但由于分泌的FGF2的浓度非常低，很少有报道提供FGF2分泌的测量[17,18]。也许是因为这个原因，FGF2并不被认为是介导植入MSC对周围的神经组织的再生作用的主要候选者。DNTT-MSCDNTT-MSC(“NICD瞬时转染的MSC的后代”)是可以通过用编码Notch细胞内结构域(NICD)(例如人Notch1细胞内结构域(NICD1))的载体瞬时转染MSC和随后进行选择和随后的扩增而从人骨髓MSC衍生的细胞群。与亲代MSC相比，该过程产生在体外表现出优异的血管生成和神经生长(即，神经前体细胞的生长和分化)性质的细胞群体[19-21]。DNTT-MSC的神经发生作用归因于FGF1，FGF2和BMP的增加的表达和从而增加的分泌[19,22]。然而，非常低水平的FGF2由MSC或DNTT-MSC分泌。Tate等人(2010)CellTransplantation19:973-984。因此，如果FGF2全部或部分负责MSC和/或DNTT-MSC的神经发生作用，则其来源仍然是难以捉摸的。概述间充质细胞(例如，成纤维细胞、MSC和DNTT-MSC)含有FGF2的细胞内储存；但是细胞内FGF2很少被分泌在培养物中。相反，间充质细胞的损伤或死亡导致其细胞内FGF2的释放。本专利技术人已经发现间充质细胞含有FGF2的特别大的细胞内储存，其在释放时可以在许多体外模型系统中对相邻细胞或组织施加神经发生和血管生成作用。此外，间充质细胞含有FGF2同种型的混合物，并且该同种型混合物具有比单一同种型(即重组FGF2)更高的生物学活性。因此，本公开内容(除其它以外)提供以下实施方案。1.一种用于诱导神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法，所述方法包括将神经前体细胞或内皮细胞与从间充质细胞获得的制剂接触，所述制剂选自细胞裂解物、可溶性无细胞提取物和不溶性细胞残留物。2.一种诱导星形胶质细胞前体细胞向星形胶质细胞的发育的方法，所述方法包括使星形胶质细胞前体细胞与活间充质细胞和间充质细胞的细胞裂解物的混合物接触。3.一种向细胞或组织提供FGF2同种型的混合物的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与从间充质细胞获得的制剂接触，所述制剂选自细胞裂解物、可溶性无细胞提取物和不溶性细胞残留物。4.一种用于将FGF2同种型的混合物递送到有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者中引入从间充质细胞获得的制剂，所述制剂选自细胞裂解物、可溶无细胞提取物和不溶性细胞残留物。5.实施方案3的方法，其中所述混合物包含分子量为18、22、22.5和24kD的FGF2同种型。6.实施方案4的方法，其中所述混合物包含分子量为18、22、22.5和24kD的FGF2同种型。7.实施方案3的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。8.实施方案4的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。9.实施方案3的方法，其中所述细胞是神经前体细胞。10.实施方案3的方法，其中所述细胞是内皮细胞。11.实施方案4的方法，其中所述受试者已经经历了缺血性损伤。12.实施方案11的方法，其中所述缺血性损伤是中风。13.实施方案3的方法，其中所述组织是坏死的。14.实施方案13的方法，其中坏死是由梗死或创伤性损伤引起的。15.实施方案1的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。16.实施方案2的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。17.实施方案3的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。18.实施方案4的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。19.一种用于将FGF2同种型的生物活性混合物递送至组织的方法，所述方法包括：使组织与间充质细胞接触；其中所述接触导致间充质细胞的裂解或破裂。20.实施方案19的方法，其中所述FGF2同种型的分子量为18、22、22.5和24kD。21.实施方案19的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。22.实施方案19的方法，其中所述组织包含一个或多个神经前体细胞。23.实施方案19的方法，其中所述组织包含一个或多个内皮细胞。24.实施方案19的方法，其中所述组织存在于已经经历缺血性损伤的受试者中。25.实施方案24的方法，其中所述缺血性损伤是中风。26.实施方案19的方法，其中所述组织是坏死的。27.实施方案26的方法，其中坏死是由梗塞或创伤性损伤引起的。28.实施方案19的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于诱导神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法，所述方法包括将神经前体细胞或内皮细胞与从间充质细胞获得的制剂接触，所述制剂选自细胞裂解物、可溶性无细胞提取物和不溶性细胞残留物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.01 US 62/178,190;2015.08.13 US 62/204,7761.一种用于诱导神经前体细胞或内皮细胞增殖的方法，所述方法包括将神经前体细胞或内皮细胞与从间充质细胞获得的制剂接触，所述制剂选自细胞裂解物、可溶性无细胞提取物和不溶性细胞残留物。2.一种诱导星形胶质细胞前体细胞向星形胶质细胞的发育的方法，所述方法包括使星形胶质细胞前体细胞与活间充质细胞和间充质细胞的细胞裂解物的混合物接触。3.一种向细胞或组织提供FGF2同种型的混合物的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与从间充质细胞获得的制剂接触，所述制剂选自细胞裂解物、可溶性无细胞提取物和不溶性细胞残留物。4.一种用于将FGF2同种型的混合物递送到有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者中引入从间充质细胞获得的制剂，所述制剂选自细胞裂解物、可溶无细胞提取物和不溶性细胞残留物。5.权利要求3的方法，其中所述混合物包含分子量为18、22、22.5和24kD的FGF2同种型。6.权利要求4的方法，其中所述混合物包含分子量为18、22、22.5和24kD的FGF2同种型。7.权利要求3的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。8.权利要求4的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。9.权利要求3的方法，其中所述细胞是神经前体细胞。10.权利要求3的方法，其中所述细胞是内皮细胞。11.权利要求4的方法，其中所述受试者已经经历了缺血性损伤。12.权利要求11的方法，其中所述缺血性损伤是中风。13.权利要求3的方法，其中所述组织是坏死的。14.权利要求13的方法，其中坏死是由梗塞或创伤性损伤引起的。15.权利要求1的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。16.权利要求2的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。17.权利要求3的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。18.权利要求4的方法，其中所述间充质细胞选自成纤维细胞，间充质干细胞(MSC)和DNTT-MSC。19.一种用于将FGF2同种型的生物活性混合物递送至组织的方法，所述方法包括：使组织与间充质细胞接触；其中所述接触导致间充质细胞的裂解或破裂。20.权利要求19的方法，其中所述FGF2同种型的分子量为18、22、22.5和24kD。21.权利要求19的方法，其中所述混合物具有比重组FGF2更高的生物活性。22.权利要求19的方法，其中所述组织包含一个或多个神经前体细胞。23.权利要求19的方法，其中所述组织包...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·埃兹曼，D·巴特斯，
申请(专利权)人：桑比欧公司，
类型：发明
国别省市：美国,US