一种用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架及其制备方法，所述复合丝素蛋白支架的体积为1.5‑2.0mm

A bone induced composite silk fibroin scaffold for MRI contrast and its preparation method

The invention discloses a method for inducing silk fibroin composite scaffold and preparation method for MRI imaging of bone, the silk fibroin composite scaffold volume is 1.5 2.0mm

【技术实现步骤摘要】
一种用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架及其制备方法
本专利技术属于生物医学工程材料领域，具体地说，本专利技术涉及一种用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架及其制备方法。
技术介绍
随着影像学技术的发展，各种功能影像学应运而生。磁共振成像(Magneticresonanceimaging,MRI)因其具有非侵入性、安全性、提供的诊断信息丰富而被有效地应用于监控组织工程支架。通过使用造影剂，能够有效提高磁共振诊断的敏感性和特异性、增强信号对比度和提高软组织图像分辨率。超顺磁四氧化三铁是一类具有顺磁性、负性效应显著的纳米粒子，已经成为磁共振成像领域研究的热点。牙髓干细胞(Dentalpulpstemcells,DPSCs)具有较弱的成骨、成软骨和成脂能力，更好的免疫调节能力等干细胞特性。牙髓干细胞体内异位移植实验能形成牙本质牙髓样复合体结构、成牙本质样细胞及骨样组织，随着生命科学的进步，牙髓干细胞作为人自身重要的干细胞之一，必将成为牙组织相关的再生医学开辟广阔的前景。牙髓再生的过程中，种子细胞以何种形式复合支架材料是亟待解决的问题。所需支架不仅能促进细胞贴附、生长分化及生物性的三维环境，而且具有良好的生物相容性、无毒及合适的物理机械性。丝素蛋白(Silkfibroin，SF)是一种从蚕茧中提取的天然生物材料，因其具有无毒、无刺激、良好的生物相容性，通过加工、修饰使降解具有可控性，降解产物易吸收，免疫抗原性低等优点而被作为组织工程的支架材料，成为了研究的热点。羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAp)作为常用的组织工程支架材料，具有较高的压缩强度、耐磨性和化学稳定性。矿化组织工程有关的研究表明：羟基磷灰石与天然骨骼中，无机矿物质化学组成成份相近，而且置入机体内能表现出骨诱导功能，生物活性佳；降解后可以被新生骨组织吸收和替代；但是羟基磷灰石也存在着无机材料所具有的加工困难、强度较差、制作的支架孔隙率低等缺点；另外，材料本身的脆性和降解速率极低，也在一定程度上限制了其在矿化和骨有关的组织工程中的应用。目前利用丝素蛋白作为复合支架用于骨修复早已成为热点，羟基磷灰石在支架上的应用也屡见不鲜，而用于磁共振成像的负载牙髓干细胞的复合丝素蛋白支架有很多性能有待研究。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有组织工程支架的缺陷，本专利技术提供了一种用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架及其制备方法和应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架，所述复合丝素蛋白支架的体积为1.5-2.0mm3，所述复合丝素蛋白支架上负载有3×105～7×105个牙髓干细胞，所述复合丝素蛋白支架是以2～10％丝素蛋白溶液、以及羟基磷灰石和超顺磁性四氧化三铁形成的分散液为原料制备而得，所述羟基磷灰石与超顺磁性四氧化三铁的质量比为0.1g：0.25～1.0mg，所述羟基磷灰石与超顺磁性四氧化三铁形成的分散液与丝素蛋白溶液的体积比为0.5～1.5：10。在其中一些实施例中，所述羟基磷灰石与超顺磁性四氧化三铁的质量比为：0.1g：0.25～0.5mg。在其中一些实施例中，所述羟基磷灰石与超顺磁性四氧化三铁形成的分散液与丝素蛋白溶液的比为1：10。本专利技术还提供了上述用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架的制备方法，采取了以下技术方案：一种用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架的制备方法，包括以下步骤：(1)、将0.25～1.0mg超顺磁性四氧化三铁和0.1g羟基磷灰石分散于0.5～1.5ml去离子水中，再超声6-15min，得到分散液；(2)、将8～15ml2～10wt％的丝素蛋白溶液加入到步骤(1)的分散液中，室温涡旋3～8min，冷藏结晶，冷冻干燥。(3)、将30～70μl浓度为1×107个/ml的牙髓干细胞悬浮液滴加到步骤(2)的复合丝素蛋白支架上，培养孵育，即得负载牙髓干细胞的复合丝素蛋白支架。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述冷藏结晶的温度为-80℃。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述冷冻干燥条件为-60℃，48h。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述丝素蛋白的制备方法为：将蚕茧加入去离子水中，同时加入NaHCO3，煮沸20～40min取出，清洗至中性，再重复煮一遍取出，烘干，即得。在其中一些实施例中，所述蚕茧是去蛹蚕茧。在其中一些实施例中，步骤(2)中所述丝素蛋白溶液的制备方法为：在丝素蛋白中加入浓度为9.3mol/L的溴化锂溶液，40～60℃水浴加热溶解4～6h，取出丝素蛋白混合液透析3～5天，每天更换1～3次去离子水，将完成透析的溶液离心，取出上层清液置于浓度为10～25wt％的聚乙二醇溶液中进行反透析8～24h，更换1～2次聚乙二醇溶液，即得丝素蛋白溶液。在其中一些实施例中，所述透析的截留分子量为8-14kD。在其中一些实施例中，所述离心条件为25℃，5000r/min，10～15min。在其中一些实施例中，步骤(3)中所述牙髓干细胞悬浮液的制备方法：取长满牙髓干细胞的培养瓶，弃去旧的培养基，用磷酸缓冲液清洗2遍；取0.6～1ml的胰蛋白酶加入到细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱内消化1～2min；待细胞形态开始皱缩，加入等体积的含有10％的胎牛血清和1％的青链霉素混合液的DMEM-F12的培养液，并轻轻反复吹打培养瓶的底部，将细胞移入离心管，1000r/min离心5min，弃去上清液，加入1ml的培养液，吹打混匀，用细胞计数板进行计数；将细胞悬浮液的浓度调整为1×107个/ml。本专利技术的用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架利用丝素蛋白和羟基磷灰石用于骨修复的优势；再将适量的超顺磁性四氧化三铁标记物掺入复合支架中，使用磁共振成像监测复合支架可提高其信号对比度以及图像的分辨率；再负载牙髓干细胞能形成牙本质牙髓样复合体结构、成牙本质样细胞及骨样组织，进而用磁共振监测新型支架在骨修复过程中的变化，可监测复合体系体外及体内形貌特征变化、功能和分子生物学方面的信息。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术的用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架具有合适的孔径和孔隙率，孔径为50-240μm，孔隙率为70％-95％，有利于牙髓干细胞的粘附和增殖，克服了现有支架材料欠缺的一些问题；合适剂量的超顺磁性四氧化三铁掺入丝素蛋白支架中，将支架植入体内，能够使得磁共振成像图谱更清晰；多种物质复合，保持了原物质的优点，解决了单一原有材料性的不足；2、本专利技术用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架的制备工艺简单，所需的原材料易得，制备的复合支架有望在生物材料领域得到广泛的应用；超顺磁四氧化三铁作为组织工程支架的标记物，有望在临床医学上得到应用。附图说明图1为本专利技术实施例1～4和对比实施例1、2的磁共振影像图；图2为实施例1的复合丝素蛋白支架的FT-IR图，图中可知实施例1的复合支架为物理混合，包含单体物质的性能；图3为实施例1～4的复合丝素蛋白支架的质量分析图；图4为实施例1～4的复合丝素蛋白支架在扫描电子显微镜下的结构图，由图可知实施例1的复合支架孔径均匀，平均孔径为50-130μm，测出的孔隙率约为85％；图5为实施例1～4的复合丝素蛋白支架的细胞增殖率图。具体实施方式下面结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架，其特征在于，所述复合丝素蛋白支架的体积为1.5‑2.0mm

【技术特征摘要】
1.一种用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架，其特征在于，所述复合丝素蛋白支架的体积为1.5-2.0mm3，所述复合丝素蛋白支架上负载有3×105～7×105个牙髓干细胞，所述复合丝素蛋白支架是以2～10％丝素蛋白溶液、以及羟基磷灰石和超顺磁性四氧化三铁形成的分散液为原料制备而得，所述羟基磷灰石与超顺磁性四氧化三铁的质量比为0.1g：0.25～1.0mg，所述羟基磷灰石和超顺磁性四氧化三铁形成的分散液与丝素蛋白溶液的体积比为0.5～1.5：10。2.根据权利要求1所述的用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架，其特征在于，所述羟基磷灰石与超顺磁性四氧化三铁的质量比为：0.1g：0.25～0.5mg。3.根据权利要求1所述的用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架，其特征在于，所述羟基磷灰石与超顺磁性四氧化三铁形成的分散液与丝素蛋白溶液的比为1：10。4.权利要求1～3任一项所述的用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、将0.25～1.0mg超顺磁性四氧化三铁和0.1g羟基磷灰石分散于0.5～1.5ml去离子水中，再超声6-15min，得到分散液；(2)、将8～15ml的2～10wt％的丝素蛋白溶液加入到步骤(1)的分散液中，室温涡旋3～8min，冷藏结晶，冷冻干燥。(3)、将30～70μl浓度为1×107个/ml的牙髓干细胞悬浮液滴加到步骤(2)的复合丝素蛋白支架上，培养孵育，即得负载牙髓干细胞的复合丝素蛋白支架。5.根据权利要求4所述的用于MRI造影的骨诱导复合丝素蛋白支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述冷藏结晶的温度为-80℃。6.根据权利要求4所述的用于MRI造影的骨诱导复...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭瑞，李丹，蓝咏，
申请(专利权)人：广州贝奥吉因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44