一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法，属于高分子材料和医学工程技术领域。本发明专利技术的分子探针为两亲性共聚物形成的核壳结构，内核层由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺片段形成，外壳层由聚乙二醇片段形成，所述内核层中包裹超顺磁性纳米颗粒，所述外壳层末端与B6短肽相连接，所述外壳层表面与Cy5.5‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯相连接。本发明专利技术的分子探针具有MRI/荧光双模态、双靶点、高灵敏度、高分辨率和生物相容性良好的优点。

A Molecular Probe for Early Diagnosis of Hepatocellular Carcinoma and Its Preparation Method

The invention relates to a molecular probe for early diagnosis of liver cancer and a preparation method thereof, belonging to the field of polymer materials and medical engineering technology. The molecular probe of the present invention is a core-shell structure formed by amphiphilic copolymer. The core layer is formed by a bisstearic phosphatidyl ethanolamine fragment and the outer layer is formed by a polyethylene glycol fragment. The inner core layer is coated with superparamagnetic nanoparticles. The end of the outer layer is connected with B6 short peptide. The outer surface of the outer layer is connected with Cy5.5 N hydroxy succinimide ester. The molecular probe of the invention has the advantages of dual-mode MRI/fluorescence, double targets, high sensitivity, high resolution and good biocompatibility.

【技术实现步骤摘要】
一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法
本专利技术涉及一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法，属于高分子材料和医学工程

技术介绍
肝癌的早期诊断和治疗是摆在各国科学家面前亟待攻克的难题，目前全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。中国肝癌病人约占全球发病人数的55％，已经严重威胁我国人民健康和生命。由于肝癌多由肝炎和肝硬化转移而来，恶性程度高，手术切除后容易转移和复发，因此临床上仍普遍采用口服或注射的抗癌化疗药物治疗(化疗)。然而，药物在肿瘤部位的特异性聚集效果不佳，缺乏有效的靶向技术，导致正常细胞也受到药物的攻击，不可避免地产生毒副作用；而且治疗过程与成像示踪(或诊断)亦不能同时进行，对迅速发展、转移的肿瘤遏制效果有限。因此，发展集靶向治疗与成像示踪于一体的新技术手段，成为目前肝癌诊疗中面临的一个重要课题。分子影像学是采用非侵入性的手段在活体内表征、量度和观测人或者动物体内的细胞水平和分子水平的生物学过程，并对之进行成定性和定量的研究。与传统影像学相比，在疾病诊断方面，它能够在机体完整的微环境状态下对体内组织器官微观病变进行分子水平的探测与显像，因此可以从生理、生化水平认识疾病，阐明病变组织生物过程的变化、病变细胞基因表达、代谢活性以及细胞层面生物活动的状态，为早期诊断、治疗和病理的研究提供分子水平信息。分子探针是分子显像的关键，在分子成像中对分子探针的要求包括：具备生物学兼容性，能够在人体参与正常生理代谢；能够克服生理屏障，如血管壁、脑屏障、细胞膜等；分子探针和靶向分子的结合具有高度的灵敏度、特异性。2004年，Gao等(Nat.Biotechnol.,2004,22:969-976)首次对小动物体内肿瘤进行了活体成像，他们用聚合物纳米颗粒层和聚乙二醇包覆量子点，并将其附着在前列腺特异性的单克隆抗体上，然后将这种量子点注射到有前列腺肿瘤的裸鼠循环系统。通过荧光成像分析技术发现，量子点主要聚集在肿瘤周围。荧光成像分析可得到实体瘤敏感的多色荧光图，获得肿瘤大小和定位信息。Nasongkla等(NanoLett.,2006,6:2427-2430)对载有超顺磁性铁氧化物的聚合物胶束进行了系统研究，发现其在癌细胞双重靶向输运和磁共振成像(MRI)方面有很好的应用前景，对于恶性肿瘤的诊断具有重要意义。MRI探针要想用于肝癌的早期诊断，还存在如下几个严峻的挑战：(1)尽可能小的粒径；小的粒径是保障探针克服各种生物传递屏障，进入靶部位的前提，同时也可避免探针堵塞肺部毛细血管。(2)增强特异性和敏感性；需要寻找特异性更强的靶向分子，以实现探针的高度特异性，增强靶区信号改变的同时降低非特异性区域的背景信号。(3)在核素的选择上，简化核素标记反应的步骤，提高标记反应的得率，缩短标记反应和纯化的时间。然而，目前所使用的成像技术均有一个共同的缺点：灵敏度低、准确性差，尤其不能对肿瘤部位的边界进行很明确的确定，不利于肿瘤的切除与治疗。相对于其他成像技术而言，纳米颗粒通过与靶向分子偶联，可以增强其在靶部位的富集，起到更优的成像或治疗效果。而快速、便捷的荧光成像技术正好弥补这一缺陷，因此，多模态成像已成为分子影像发展的趋势。其中，MRI/荧光成像既能发挥荧光的功能分子显像特性，又能发挥MRI的高分辨的解剖学特性以及MRI功能特性，且避免了CT的电离损伤。MRI/荧光成像技术的发展对MRI/荧光多功能分子影像探针的研究提出需求，高度特异性、成像多功能化以及良好的生物相容性成为亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于肝癌早期诊断的分子探针及其制备方法，本专利技术的分子探针具有MRI/荧光双模态、双靶点、高灵敏度、高分辨率和生物相容性良好的优点。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种用于肝癌早期诊断的分子探针，所述分子探针为两亲性共聚物形成的核壳结构，内核层由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺片段形成，外壳层由聚乙二醇片段形成，所述内核层中包裹超顺磁性纳米颗粒，所述外壳层末端与B6短肽相连接，所述外壳层表面与Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯相连接。本专利技术以与肝癌细胞特异性结合的B6短肽(氨基酸序列为：CGHKAKGPRK)为靶标，制备聚合物纳米胶束载体(DSPE-PEG)，同时将超顺磁性铁氧体纳米粒子(SPIO)通过疏水静电作用与载体组装复合在一起，最后将Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰在胶束表面，合成胶束(SPIO-DSPE-PEG-Cy5.5/B6)，构筑用于肝癌早期诊断的具有MRI/荧光双模态靶向成像的分子探针。本专利技术的分子探针为纳米载体，采用两亲性共聚物形成的一种核壳结构，其内核层由疏水性二硬脂酰磷脂酰乙醇胺片段形成，外壳层由亲水性聚乙二醇片段形成，B6多肽分子通过酰胺化反应连接在胶束亲水表面，Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯通过载体表面氨基修饰。本专利技术的分子探针可以实现靶向聚集在肿瘤部位成像，且同时控制药物的释放。本专利技术在纳米载体的自组装过程中，将疏水性磁性纳米粒子包裹在聚合物载体的疏水内核中，并将靶向基团B6短肽分子偶联在亲水性链末端，保证胶束形成后靶向分子位于载体的外壳层，同时将荧光染料分子Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯通过纳米载体表面的官能团进行连接，合成本专利技术提出的双模态靶向性纳米胶束探针B6-DSPE-PEG-SPION/Cy5.5，使其具备肝癌细胞主动靶向识别和MRI/荧光显影效果。作为本专利技术所述分子探针的优选实施方式，所述分子探针的粒径为50～250nm。作为本专利技术所述分子探针的优选实施方式，所述超顺磁性纳米颗粒的粒径为5～30nm。作为本专利技术所述分子探针的优选实施方式，所述B6短肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。作为本专利技术所述分子探针的优选实施方式，所述分子探针包含以下重量份的组分：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基5～20份、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺5～20份、超顺磁性纳米颗粒1～5份、Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯十分之一至百分之一份、B6短肽百万分之一份至十万分之一份。作为本专利技术所述分子探针的优选实施方式，所述超顺磁性纳米颗粒的制备方法为：将三乙酰丙酮铁、二乙酰丙酮锰、二乙酰丙酮锌与1,2-十六烷二醇混合，然后加入油酸和油胺，并加入二苄醚作为溶剂，氩气保护下反应，200℃反应2h，然后加热至300℃回流反应0.5h，得到超顺磁性纳米颗粒。本专利技术还提供了上述分子探针的制备方法，包括以下步骤：(1)将超顺磁性纳米颗粒加入四氢呋喃中，并加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺混合，室温下超声，加入至去离子水中，得混合溶液；(2)将步骤(1)所得的混合溶液置于透析袋中透析，收集透析袋中的胶束水溶液，然后冷冻干燥，得粉末状固体；(3)将步骤(2)所得的粉末状固体配制成胶束溶液，加入Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，活化后加入N-羟基琥珀酰亚胺发生反应，然后加入B6短肽，反应过夜；(4)将步骤(3)的反应液在蒸馏水中透析，将透析后的溶液冷冻干燥得到分子探针。作为本专利技术所述分子探针的制备方法的优选实施方式，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于肝癌早期诊断的分子探针，其特征在于，所述分子探针为两亲性共聚物形成的核壳结构，内核层由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺片段形成，外壳层由聚乙二醇片段形成，所述内核层中包裹超顺磁性纳米颗粒，所述外壳层末端与B6短肽相连接，所述外壳层表面与Cy5.5‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯相连接。

【技术特征摘要】
1.一种用于肝癌早期诊断的分子探针，其特征在于，所述分子探针为两亲性共聚物形成的核壳结构，内核层由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺片段形成，外壳层由聚乙二醇片段形成，所述内核层中包裹超顺磁性纳米颗粒，所述外壳层末端与B6短肽相连接，所述外壳层表面与Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯相连接。2.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述分子探针的粒径为50～250nm。3.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述超顺磁性纳米颗粒的粒径为5～30nm。4.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述B6短肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。5.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述分子探针包含以下重量份的组分：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基5～20份、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺5～20份、超顺磁性纳米颗粒1～5份、Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯万分之一至十万分之一份、B6短肽十万分之一至百万分之一份。6.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述超顺磁性纳米颗粒的制备方法为：将三乙酰丙酮铁、二乙酰丙酮锰、二乙酰丙酮锌与1,2-十六烷二醇混合，然后加入油酸和油胺，并加入二苄醚作为溶剂，氩气保护下反应，200℃反应2h，然后加热至300℃回流反应0.5h，得到超顺磁性纳米颗粒。7.如权利要求1～6任一项所述的分子探针的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉，蓝咏，邓立，冯龙宝，
申请(专利权)人：广州贝奥吉因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44