一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法技术

本发明专利技术提供一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法：1)将样品溶解于氘代试剂并转移至核磁管，向核磁管中再加入内标物；2)采用NMR中的氢共振频率采样；3)选取被测组分的特征结构信号峰和内标物信号峰，采用内标法定量计算被测组分含量。本发明专利技术选择NMR技术对中药活性组分的含量进行检测，可以对中药提取物、初步分离化合物或其混合物和天然来源小分子化合物等中活性组分进行快速定量分析，给出摩尔含量。本发明专利技术具有操作简单，快速批量实现，实验重现性好，实验数据直观可靠等特点，特别适用于微量样品的检测；为中药或复方的药效物质基础研究提供了一条快速定量的思路和方法。

A rapid method for quantitative determination of active components in traditional Chinese medicine based on NMR Technology

The present invention provides a method for rapid quantitative NMR technology of active components in traditional Chinese medicine based on: 1) the sample is dissolved in deuterated reagent and transferred to the NMR tube, to the NMR tube is added to the internal standard; 2) by hydrogen resonance frequency in NMR sampling; 3) select the component to be measured the characteristic structure of the letter the peak and the internal standard peak signal, the quantitative calculation of the analyte content by internal standard method. The present invention selects NMR technology to detect the content of active components in traditional Chinese medicine, and can rapidly and quantitatively analyze active components of traditional Chinese medicine extract, preliminary separation compound or its mixture and natural source small molecule compound, and gives molar content. The method has the advantages of simple operation, rapid batch realization, good experimental reproducibility, and intuitive and reliable experimental data, which is especially suitable for the detection of trace samples, and provides a fast and quantitative thinking and method for the study of the pharmacodynamic material basis of traditional Chinese medicine or compound prescription.

【技术实现步骤摘要】
一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法
本专利技术涉及一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法，属于中药学领域。
技术介绍
中药的药效物质基础研究是中药现代化过程中的核心问题。传统的“分离-鉴定-筛选”的天然药物化学研究模式工作量大、分离效率低；同时，成分复杂和药效物质含量相对低的特点增加了药效物质研究的难度，也限制了中药现代化的步伐。与此同时，现代药理学的构效关系研究则需要明确知道活性物质的含量。活性导向的中药体外快速筛选方法是中药现代化的重要方法之一。该方法以特定药理活性为目标，采用体外酶或细胞模型为工具，有针对性的优化分离条件，快速获得中药活性组分和特定药理活性的初步定量构效关系(QSAR)。总之，如何获得微量乃至痕量活性成分的定量信息对中药现代化有着重要的意义。HPLC-UV和HPLC-MS/MS是中药微量组分定量分析的常用方法，然而对于复杂的中药组分来说，这两种方法均有一定的局限性。HPLC-UV适用于紫外吸收较强化合物的定量分析，其分析的灵敏度较差，并且由于化合物摩尔消光系数的差异，化合物定量测定需要用标准样品来制作标准曲线，进而得出被测物质的含量，对于复杂的中药组分来说，绘制每一个化合物的标准曲线显然是非常费事，也是不现实的，并且很多成分还是未知的。因此，该方法适用于含量相对较高、且有紫外吸收的已知化合物的含量测定。HPLC-MS/MS是灵敏度非常高，且适用范围更广泛的定量方法。无论化合物是否有紫外吸收，均可用该方法测定含量，常用来研究复杂基质中的微量至痕量物质的定量分析。当用外标法测定含量时同样需要标准样品来绘制标准曲线，其缺点与HPLC-UV一样。当用内标法时不需要标准品，但是需要内标物与被测物质的校正因子相同，由于MS原理的限制，相同条件下，不同结构类型化合物的离子化程度有非常大的区别，校正因子差别同样很大，无法找到一种内标物来同时测定不同结构类型的化合物。鉴于以上分析，在中药现代药理学的构效关系研究中对于具有相同特征结构的同一类活性组分的快速、准确定量分析是一个需要亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：1)将中药样品溶解于氘代试剂后转移至核磁管(核磁管例如选自外径为1.7mm、2.1mm或5mm的石英或高硼硅核磁管)，然后向该核磁管中加入内标物，得到分析样品；2)通过采用NMR中的氢共振频率对分析样品采样，完成样品检测；3)根据采样得到的氢共振信号，选取与被测组分的特征结构对应的信号峰和内标物的某特征信号峰，采用内标法定量计算被测组分含量，所述被测组分是指可以依据所述特征结构与所述中药样品中其他活性物质相区别的某一个或某一类活性物质。所述定量中药活性组分的方法还包括以下步骤：样品检测完成后，向所述分析样品中加入可与所述氘代试剂互溶的含水混合溶剂，然后通过冷冻离心浓缩回收中药样品。所述中药样品选自中药原料药提取物、中药复方制剂、经分离手段得到的化合物或其混合物、天然来源小分子化合物或合成的小分子化合物；检测中中药样品所需用量为1～100mg。所述氘代试剂选自CDCl3、DMSO-d6、CD3OD、acetone-d6、THF-d8、DMSO-d6、benzene-d6、toluene-d8、D2O、pyridine-d5或acetonitrile-d3；中药样品溶解中氘代试剂的用量为0.3～0.6mL。所述内标物选自反式二氯乙烯、顺式二氯乙烯、三氯乙烯、对二氯苯、对二氟苯、间三氟苯、1,2,3,4-四氟苯、1,2,4,5-四氟苯、1,3,4,5-四氟苯、五氟苯中的一种或两种以上的组合；所述内标物在加入核磁管前预先用所述氘代试剂制成溶液，该溶液的用量为1～10μL，且内标物总浓度为0.1～1M。所述采样中，脉冲序列的角度为30～90度，弛豫时间≥5s，扫描次数为32～1024次，探头温度为20～40℃，谱峰宽度≤20ppm，优选0～10ppm。所述特征结构对应的信号峰，对于双键选自δ6.1～6.5ppm的s、d、dd、t或m峰，对于甲氧基选自δ3.6～4.2ppm的s峰，对于芳环选自δ6.5～7.5ppm的s或d峰，对于醛选自δ7.5～9.5ppm的s峰，对于酸选自δ9.5～12.5ppm的s峰，对于缩醛、缩酮、半缩醛及半缩酮选自δ4.5～6.5ppm的s峰。所述被测组分在所述中药样品中的摩尔含量按照以下公式计算：M活＝c标×V标×A活×f标/(A标×f活)＝M标×A活×f标/(A标×f活)(1)公式(1)中，M活为被测组分的摩尔数；M标为内标物的摩尔数；c标为所加内标物的摩尔浓度，V标为所加内标物的体积数；A活为所述特征结构对应的信号峰的峰面积；A标为选取的内标物特征信号峰的峰面积，f标为单位摩尔数内标物特征信号峰的峰面积，f活为单位摩尔数被测组分特征结构对应的信号峰的峰面积。所述混合溶剂的用量为分析样品体积的10～100倍，所述混合溶剂的含水量按体积分数计≥80％；所述冷冻离心的条件为：离心转速为500～4000rpm，样品室温度为20～60℃，冷冻温度≤-20℃，时间为2～24h。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术采用NMR方法测定内标物和中药活性组分的氢共振频率，利用NMR可以对化合物中不同结构进行定性和定量的特点，通过内标法对被测组分区别于中药样品中其他活性物质的化学结构特征进行定量分析，能够在未知化合物或混合物摩尔分子量的前提下快速、准确的给出被测组分的摩尔含量，解决了针对具有相同特征结构的同一类天然活性物质的快速、准确定量分析的问题，有利于活性筛选的定量比较；本专利技术具有操作简单，快速批量实现，实验重现性好，实验数据直观可靠等特点，特别适用于微量样品的检测，为中药或复方的药效物质基础研究提供了一条快速定量的思路和方法。进一步的，本专利技术的定量分析方法是一种无损分析方法，样品检测完后加入混合溶剂，通过冷冻离心浓缩回收，被测样品回收率高，且不受内标物的影响，为珍贵样品(例如，经分离手段得到的化合物或其混合物、天然来源小分子化合物或合成的小分子化合物)的下一步活性筛选提供便利，降低药物研究的时间消耗和成本。进一步的，本专利技术通过内标物信号峰和被测组分中特征结构的信号峰的峰面积比值来定量分析被测组分，结合大量的中药指纹图谱数据，所筛选的内标物具有天然活性物质不具备的结构特征，从而不与天然活性物质特征信号峰重叠(定量计算时需要进行峰面积求取，部分重叠以及全部重叠的信号峰无法用于定量，故要求二者的信号峰能够分开)，而且内标物自身的化学位移值仅对应一个特征吸收峰，可以在内标物用量限制下实现被测组分的快速、准确定量分析。另外，检测样品回收中使用了冷冻离心，因此，内标物的筛选也兼顾了检测样品回收的要求，即内标物的沸点需较低，通常低于水的沸点，若超过水的沸点，则必须保证在冷冻离心中可以分离。进一步的，本专利技术通过优化脉冲序列中的角度、弛豫时间、扫描次数、探头温度等参数，使得本专利技术对天然活性组分的定量普遍适用，消除了信号峰飘移对定量结果的影响，不必要求内标物信号峰与被测组分特征结构的信号峰在峰位置上接近，使活性组分定量更为灵活、更为准确。另外，本专利技术在结合NMR的自动进样器后，可以实现无本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法，其特征在于：该定量中药活性组分的方法包括以下步骤：1)将中药样品溶解于氘代试剂后转移至核磁管，然后向该核磁管中加入内标物，得到分析样品；2)通过采用NMR中的氢共振频率对分析样品采样，完成样品检测；3)根据采样得到的氢共振信号，选取与被测组分的特征结构对应的信号峰和内标物的特征信号峰，采用内标法定量计算被测组分含量，所述被测组分是指可以依据所述特征结构与所述中药样品中其他活性物质相区别的某一个或某一类活性物质。

【技术特征摘要】
1.一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法，其特征在于：该定量中药活性组分的方法包括以下步骤：1)将中药样品溶解于氘代试剂后转移至核磁管，然后向该核磁管中加入内标物，得到分析样品；2)通过采用NMR中的氢共振频率对分析样品采样，完成样品检测；3)根据采样得到的氢共振信号，选取与被测组分的特征结构对应的信号峰和内标物的特征信号峰，采用内标法定量计算被测组分含量，所述被测组分是指可以依据所述特征结构与所述中药样品中其他活性物质相区别的某一个或某一类活性物质。2.根据权利要求1所述一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法，其特征在于：所述定量中药活性组分的方法还包括以下步骤：样品检测完成后，向所述分析样品中加入可与所述氘代试剂互溶的含水混合溶剂，然后通过冷冻离心回收中药样品。3.根据权利要求1或2所述一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法，其特征在于：所述中药样品选自中药原料药提取物、中药复方制剂、经分离手段得到的化合物或其混合物、天然来源小分子化合物或合成的小分子化合物；检测中中药样品所需用量为1～100mg。4.根据权利要求1或2所述一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法，其特征在于：所述氘代试剂选自CDCl3、DMSO-d6、CD3OD、acetone-d6、THF-d8、DMSO-d6、benzene-d6、toluene-d8、D2O、pyridine-d5或acetonitrile-d3；中药样品溶解中氘代试剂的用量为0.3～0.6mL。5.根据权利要求1或2所述一种基于NMR技术快速定量中药活性组分的方法，其特征在于：所述内标物选自反式二氯乙烯、顺式二氯乙烯、三氯乙烯、对二氯苯、对二氟苯、间三氟苯、1,2,3,4-四氟苯、1,2,4,5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈福欣，龚频，陈苏英，侯彬彬，严贝贝，
申请(专利权)人：西安科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61