生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用制造技术

本发明专利技术提供了生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3‑丙二醇生产中的应用。通过基因工程方法构建出强化tqsA基因表达的变栖克雷伯氏菌TqsA，并通过发酵工艺优化提供一种采用变栖克雷伯氏菌F2R9

Application of biological safety variable habitat Klebsiella and 1,3 in in the production of propylene glycol

The present invention provides application of biological safety variable habitat Klebsiella and 1,3 in in the production of propylene glycol. Genetic engineering method was used to construct a strain of Klebsiella TqsA that could enhance the expression of tqsA gene, and a new strain of Klebsiella pneumoniae F2R9 was obtained by optimizing the fermentation process

【技术实现步骤摘要】
生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用
本专利技术属于微生物
，涉及一种生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用。
技术介绍
1,3-丙二醇用途广泛，是非常重要的化工产品及平台化合物，可用作粘合剂、保护剂、润滑剂、抗冻剂及溶剂，在高分子材料、医药、化工、食品及化妆品领域都具有广泛应用。其最重要的用途为生产聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT的良好特性，包括水洗性、延展性及回复性都使得其市场需求日益扩大。由此拉动了1,3-丙二醇的市场需求(LiuH.etal.,BiotechnolJ.2010,5(11):1137–1148)。鉴于1,3-丙二醇的重要作用，化学法合成的种种弊端，利用微生物发酵甘油生产1,3-丙二醇的研究备受关注。目前报道的合成1,3-丙二醇的菌株主要有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、梭菌属、肠杆菌属以及乳酸菌属。其中，克雷伯氏菌属的菌株属于兼性厌氧菌，在工业应用中容易培养，且该类菌株具有良好的底物甘油耐受性及产物1,3-丙二醇耐受性，1,3-丙二醇的生产强度和转化率较高。因此，克雷伯氏菌属是研究较多的优良的1,3-丙二醇生产菌株。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)是目前研究较多，且1,3-丙二醇生产性能较好的菌株。CN103740609B公开了一株高产1,3-丙二醇克雷伯肺炎杆菌(即：肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae)，其于2013年7月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO.7824，保藏名称为ACR30；该肺炎克雷伯氏菌ACR30在5L发酵罐批次流加发酵实验中，发酵72小时1,3-丙二醇浓度达到116g/L。另有一篇文章报道过一株乳酸生产途径缺陷的产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，以及该菌株在微好氧条件下发酵生产1,3-丙二醇的应用。作者通过对产酸克雷伯氏菌M5al的乳酸脱氢酶基因进行了插入失活，获得了突变菌株产酸克雷伯氏菌LDH3。在7.5L发酵罐中，微好氧条件下，产酸克雷伯氏菌LDH3发酵甘油和糖的混合碳源(80％甘油、10％糖和10％水)，可生产83.56g/L的1,3-丙二醇，1,3-丙二醇的转化率为0.62mol/mol，1,3-丙二醇生产强度为1.61g/Lh(Yang,G.,Tian,J.,&Li,J.(2007).Fermentationof1,3-propanediolbyalactatedeficientmutantofKlebsiellaoxytocaundermicroaerobicconditions.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,73(5),1017-1024.)。然而，上述两类菌株均为条件致病菌，即生物安全2类菌。条件致病菌在工业应用中存在着较多限制及安全隐患，该类菌株生产的产品的应用范围受到严重限制(CelińskaE.CritRevBiotechnol.2012,32(3):274–288)。克雷伯氏菌属中，变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola，又名栖异地克雷伯氏菌)F2R9T是目前唯一一株被美国公共卫生服务指南——微生物和生物医学实验室的生物安全(U.S.PublicHealthServiceGuidelines,BiosafetyinMicrobiologicalandBiomedicalLaboratories)认定为非致病菌(既生物安全1类菌)的克雷伯氏菌。变栖克雷伯氏菌F2R9T分离自香蕉根部，在美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection，ATCC)的保藏编号为ATCCBAA-830(MónicaRosenbluethetal.,System.Appl.Microbiol.2004,27:27–35)。目前，还没有使用变栖克雷伯氏菌F2R9T发酵特性的研究，也没有使用变栖克雷伯氏菌F2R9T或者其衍生菌株生产1,3-丙二醇的报道。tqsA基因编码一个转运蛋白。研究表明，大肠杆菌的tqsA基因是群体感应信号自诱导物AI-2的转运蛋白，与生物膜形成有关，对多个基因具有调控功能(Herzberg,M.,Kaye,I.K.,Peti,W.,&Wood,T.K.(2006).YdgG(TqsA)controlsbiofilmformationinEscherichiacoliK-12throughautoinducer2transport.Journalofbacteriology,188(2),587-598)。变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组注释结果表明，该菌株具有tqsA基因，但是，目前还没有对克雷伯氏菌tqsA基因的相关功能研究，也没有强化表达tqsA基因以增强微生物发酵生产1,3-丙二醇的报导。
技术实现思路
基于现有肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌在生产1,3-丙二醇上的缺陷和不足，本专利技术的一个目的在于提供一种生物安全变栖克雷伯氏菌F2R9T及其衍生菌株在生产1,3-丙二醇上的应用。一方面，本专利技术提供了变栖克雷伯氏菌F2R9T及其衍生菌株在生产1,3-丙二醇中的应用。本专利技术的变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)F2R9T是从美国模式培养物寄存库(Americantypeculturecollection，ATCC)购买获得，其编号为ATCCBAA-830。本专利技术中所用到的变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)F2R9T基因组序列可由NCBI查询获得(NCBI数据库的保藏号为NZ_CP010523.2)。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株，其为一种变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因表达增强的菌株。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株，是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为表达强度高的启动子而得到的。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达强度高的启动子为dhaD基因的启动子。本专利技术的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株，是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为dhaD基因的启动子而得到的。另一方面，本专利技术还提供了一种变栖克雷伯氏菌F2R9T衍生菌株，该菌株的tqsA基因表达增强。在本专利技术的一些具体实施方案中，该菌株是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为表达强度高的启动子(例如dhaD基因的启动子)而得到的。另一方面，本专利技术还提供一种变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法。可采用所属领域中已知的任何可行方法使得变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因表达增强而构建所述的衍生菌株。在本专利技术的一些实施方案中，本专利技术的变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株的构建方法包括以下步骤：步骤一，PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中tqsA基因启动子的上游和下游核苷酸片段，分别命名为片段A和片段B；步骤二，PCR扩增变栖克雷伯氏菌F2R9T的基因组序列中表达强度高的d本文档来自技高网...

【技术保护点】
变栖克雷伯氏菌F2R9

【技术特征摘要】
1.变栖克雷伯氏菌F2R9T或其衍生菌株在生产1,3-丙二醇中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其中，变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株为其tqsA基因表达增强的菌株。3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述变栖克雷伯氏菌F2R9T的衍生菌株是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为表达强度高的启动子而得到的。4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述表达强度高的启动子为dhaD基因的启动子。5.一种变栖克雷伯氏菌F2R9T衍生菌株，该菌株的tqsA基因表达增强。6.根据权利要求5所述的变栖克雷伯氏菌F2R9T衍生菌株，该菌株是通过将变栖克雷伯氏菌F2R9T的tqsA基因的启动子替换为表达强度高的启动子而得到的。7.一种生产1,3-丙二醇的方法，该方法包括：步骤(1)，将变栖克雷伯氏菌F2R9T或其衍生菌株接种于含有甘油的种子培养基中，摇瓶培养获得种子培养液；步骤(2)，将种子培养液接种于含有甘油的发酵培养基中，培养得到1,3-丙二醇。8.根据权利要求7所述的方法，其中，变栖克雷...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩冰，
申请(专利权)人：张家港美景荣化学工业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32