NCAM缺失在促进BMSCs向肥大软骨细胞分化中的应用制造技术

本发明专利技术提供了NCAM缺失在促进BMSCs细胞向肥大软骨细胞分化中的应用。BMSC用含10％FBS、100U/mL青霉素/链霉素的DMEM低糖培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱培养；取生长状态良好第三代BMSC接种于12孔板，待细胞贴壁生长24h后，去除原有的培养液，加入预先配制好的软骨细胞分化培养液，每隔两天换液1次。

Application of NCAM deletion in promoting differentiation of BMSCs into hypertrophic chondrocytes

The present invention provides the application of NCAM deletion in promoting the differentiation of BMSCs cells into hypertrophic chondrocytes. BMSC with 10%FBS, 100U/mL penicillin / Streptomycin DMEM low glucose medium, at 37 DEG and 5%CO2 saturated humidity cell culture incubator; take good growth status of the third generation BMSC were inoculated in 12 pore plate, when cell wall growth of 24h after the removal of culture medium of the original, with the addition of pre chondrogenic differentiation medium well, every two days for liquid 1.

【技术实现步骤摘要】
NCAM缺失在促进BMSCs向肥大软骨细胞分化中的应用
本专利技术涉及软骨细胞培养技术，具体涉及NCAM缺失在促进BMSCs细胞向肥大软骨细胞分化中的应。
技术介绍
关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，其损伤后的修复移植一直以来是医学界的难题之一。近年来，随着组织工程技术的发展，自体软骨移植在软骨损伤的临床治疗在国内外都有应用。临床研究对患者组织取材有限，并且也因为软骨细胞是终末分化细胞，体外增殖能力有限且易去分化，所以对体外软骨细胞的培养和扩增成为目前要解决的关键。由于软骨细胞属于终末分化细胞，自身的修复能力有限，破坏后很难再生，目前尚缺乏满意的治疗措施。虽然可以采用自体移植的方法治疗软骨损伤，但由于软骨细胞的取材困难，来源有限等缺点，大规模应用受到制约。骨髓间充质干细胞(bonemarrowstemcells,BMSCs)是一种多向分化潜能的成体干细胞，具有来源丰富、取材方便、增殖快、定向分化能力强等优点。在体外特定的条件下，具有向软骨、成骨、脂肪、肌腱、韧带等分化的能力。因此，BMSC因其显著优点逐渐成为软骨组织修复构建的最佳种子细胞来源之一。软骨发生的早期，骨髓间充质干细胞聚集(Condensation)，密集的细胞表达TGF-β、N-CAM等多种因子，并启动软骨细胞分化(Chondrocytedifferentiation)，随着间充质细胞向软骨细胞分化，开始分泌富含Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的细胞外基质。软骨细胞在凝聚的中心将停止分裂起始终末分化，形成肥大的软骨细胞(Hypertrophicchondrocyte)，进入肥大成熟阶段，X型胶原蛋白(ColX)、RunX2及碱性磷酸酶(ALP)等表达增强，钙累积增多，细胞增大并产生矿化的细胞外基质，肥大的软骨细胞继续钙化将形成软骨下骨细胞。综上，BMSC向软骨细胞分化并形成软骨的过程分为凝结(condensation)、软骨细胞(chondrocyte)和软骨细胞肥大(chondrocytehypertrophy)三个阶段。神经细胞粘附分子(neuralcelladhesionmolecule,NCAM；即CD56)属于免疫球蛋白超家族中的一员。NCAM具有三个不同的亚型，即NCAM120、NCAM140、NCAM180，都是以它们表面的分子大小来命名的。这三个亚型都有一个共同的细胞外的区域，但是NCAM120无胞质区及跨膜区，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)直接与膜相连，易于在膜表面运动，且只锚定于膜上的脂筏区域。NCAM140和NCAM180都有跨膜区域和不同长度的胞质尾，两者通过跨膜区与胞内细胞骨架连接便于信号转导，但是NCAM140相对于NCAM180来说，缺乏268个氨基酸序列。NCAM在神经细胞中起着非常重要的作用，包括：神经退化、迁移、分化、增殖、细胞粘附、信号传导以及学习和记忆的调节。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了NCAM缺失在促进BMSCs的软骨细胞肥大分化中的应。本专利技术的技术方案是：NCAM缺失在促进BMSCs细胞的软骨细胞肥大分化中的应用。本专利技术的进一步改进包括：通过对BMSCs细胞转染NCAMsiRNA以敲除其内的NCAM。所述BMSCs细胞由以下步骤制得：BMSC用含10％FBS、100U/mL青霉素/链霉素的DMEM低糖培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱培养；取生长状态良好第三代BMSC接种于12孔板，待细胞贴壁生长24h后，去除原有的培养液，加入预先配制好的软骨细胞分化培养液，每隔两天换液1次。所述软骨细胞分化培养液包括以下成分：FBS10％、10ng/mLTGF-β1、50nM抗坏血酸、0.1μM地塞米松和10ng/mLbFGF。NCAM缺失促进BMSCs钙结节的形成。附图说明图1：NCAM缺失的BMSCs的建立；图2A：NCAM缺失促进BMSCs的软骨细胞肥大标志物COL10a的表达；图2B：NCAM缺失促进BMSCs的软骨细胞肥大标志物RUNX2的表达；图2C：NCAM缺失促进BMSCs的软骨细胞肥大标志物SOX9的表达；图2D：NCAM缺失促进BMSCs的软骨细胞肥大标志物COL2a的表达；图3A：NCAM缺失促进BMSCs的软骨细胞肥大标志物RunX2蛋白质水平的表达；图3B：NCAM缺失促进BMSCs的软骨细胞肥大标志物ColX蛋白质水平的表达；图4A：NCAM沉默促进ATDC5细胞的软骨细胞肥大中NCAM的表达量；图4B：NCAM沉默促进ATDC5细胞的软骨细胞肥大中RunX2的表达量；图4C：NCAM沉默促进ATDC5细胞的软骨细胞肥大中钙沉积的含量。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做详细说明。材料与方法：材料与试剂C57/BL6小鼠原代野生型(NCAM+/+)和NCAM敲除(NCAM-/-)的BMSC由本实验室分离培养，ATDC5细胞购自日本细胞库RIKENCellBank；NCAMsiRNA质粒由本实验室构建；DMEM低糖、DMEM/F12培养基购自HyClone，胎牛血清(FBS)购自Gibco，0.25％胰蛋白酶(含EDTA)、青霉素-链霉素、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司，Bradford购自BIO-RAD公司；逆转录试剂盒、real-timePCR试剂盒购自南京爱必梦生物材料有限公司；ITS诱导液、茜素红、阿尔新蓝购自Sigma公司；Trizol试剂和Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；Runx2和β-actin抗体购自于CST公司，COLX抗体购自Abcam公司，NCAM抗体购自上海生工生物工程有限公司。BMSC的培养与软骨诱导分化BMSC用含10％FBS、100U/mL青霉素/链霉素的DMEM低糖培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱培养。取生长状态良好第三代BMSC接种于12孔板，待细胞贴壁生长24h后，去除原有的培养液，加入预先配制好的软骨细胞分化培养液(FBS10％、10ng/mLTGF-β1、50nM抗坏血酸、0.1μM地塞米松、10ng/mLbFGF)，每隔两天换液1次。ATDC5细胞的培养与软骨细胞诱导分化ATDC5细胞用含5％FBS、100U/mL青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱培养。取生长状态良好的ATDC5细胞接种于12孔板，待细胞贴壁生长24h后，去除原有的培养液，加入预先配制好的含ITS的软骨诱导分化培养液(FBS5％、10μg/mL人胰岛素、5.5μg/mL人转铁蛋白、5ng/mL亚硒酸钠)，每隔两天换液1次。Westernblot分析用RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，并用Bradford测定总蛋白的浓度。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转膜，用5％的脱脂牛奶封闭1h，一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后，二抗室温孵育40min，洗膜后用ECL发光液以及全自动曝光仪曝光。用ImageJ软件对蛋白条带进行扫描，定量分析相应蛋白的表达变化情况本文档来自技高网...

【技术保护点】
NCAM缺失在促进BMSCs的软骨细胞肥大分化中的应用。

【技术特征摘要】
1.NCAM缺失在促进BMSCs的软骨细胞肥大分化中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过对BMSCs细胞转染NCAMsiRNA以敲除其内的NCAM。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BMSCs细胞由以下步骤制得：BMSC用含10％FBS、100U/mL青霉素/链霉素的DMEM低糖培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱培养；取生长状态良好第三...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯志伟，程彬峰，连俊江，杨海杰，王磊，王勉，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41