软骨细胞组合物制造技术

本发明专利技术公开了软骨细胞组合物，其包括：细胞悬液和温敏型水凝胶，其中细胞悬液是通过将间充质干细胞和软骨细胞混合并重悬于胶原溶液形成的。本发明专利技术的软骨细胞组合物方便获得、安全可靠，并且，向软骨细胞分化的效率高，能够为软骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，而温敏型水凝胶具有很好的外源性细胞载体的作用，能够使组合物中的细胞充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移，从而能够有效促进软骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及软骨细胞组合物。
技术介绍
关节软骨(articularcartilage，AC)损伤是骨关节炎(osteoarthritis，OA)发生的一个主要危险因素，OA是不可逆的，当病情发展到晚期时要通过关节置换来减轻痛苦和恢复功能。由于关节软骨的修复能力是有限的，必须早期干预以防止发展成为OA。当前的治疗方式旨在通过主要治疗、邻近组织刺激和移植来修复关节软骨。通过合理的修复治疗可以在短期到中期获得较理想的结果，但较长一段时间后，容易复发。近年来，基于生物工程组织的细胞水平的组织工程技术得到广泛的研究，这种生物工程组织可以重现透明软骨的特性，并与原来的组织融为一体，对于修复关节软骨损伤意义重大。然而，目前的生物工程组织修复软骨损伤方面的研究仍有待加强。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种方便获得、安全可靠，能够有效修复软骨损伤的手段。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前应用较广泛的细胞水平的软骨修复技术之一是自体软骨细胞移植(Autologouschondrocyteimplantation，ACI)技术。该技术包含体内手术治疗和体外细胞培养技术：首先，在受损关节的非承重区域进行手术获取软骨切片，并将其转移到可储存及运输的无菌营养液中；然后，在细胞培养室中使用胶原酶消化软骨组织，得到软骨细胞，采用单层培养将软骨细胞培养扩增至可用于移植的数量，由外科医生来进行软骨缺陷的填充。在该手术过程中，将体外扩增的软骨细胞注射到缺陷处。为了使软骨细胞停留在移植部位，防止大量漂走，可以进一步将滑膜瓣缝合在损伤部位。然而，专利技术人发现，自体软骨细胞移植存在以下缺陷：1、自体软骨细胞移植需要两次侵入性手术，对病人伤害较大。2、软骨细胞在体外单层扩增期间，这些细胞群失去了它的表型，胶原蛋白的生产由II型(典型的透明软骨)向I型和III型(典型的纤维软骨)的转变。这些表型的改变的结果是具有较差的生物机械性能的细胞外基质的产生。3、供体部位提供大量的软骨细胞的能力有限。4、供体部分的发病率也是自体软骨细胞的主要障碍。而自体骨髓间充质干细胞移植也是目前应用较广泛的细胞水平的软骨修复技术。该技术在病人的髂骨进行骨髓穿刺，收集骨髓；将样品转移至洁净室进行细胞分离；向骨髓穿刺液中添加磷酸盐缓冲液，然后转移至淋巴细胞分离液中，离心并收集单个核细胞并计数，用PBS洗涤，然后接种至培养瓶中培养，以便将所得细胞扩增培养，传到第二代准备移植；移植前采用集落形成单位(Colony-formingunit,CFU)以及流式细胞术检测细胞的克隆形成能力以及细胞表面标记的表达；然后，将第二代的MSCs用胰酶消化下来，并重悬于生理血清中，并装载到无菌注射器中，透视下，将细胞注射到病人的膝盖损伤处。然而，专利技术人发现，自体骨髓间充质干细胞移植存在以下缺陷：1、骨髓穿刺给病人带来痛苦。2、细胞直接注射到损伤处，没有做其他措施，细胞可能会大量漂走。3、短中期效果理想，但长时间之后病人的损伤处疼痛有所上升，行动能力也有所下降。而间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)移植是一种很有前景的策略，因为MSCs具有高增殖能力并且具有分化为软骨细胞的潜能，进而形成软骨。MSCs是梭形细胞，具有快速增殖和自我更新能力，存在于大量组织中，包括骨髓、滑膜组织、血液、脂肪组织和骨膜组织。它们具有多系分化潜能，可以分化为多种细胞类型以创建和修复间充质组织。MSCs可以向成软骨、成骨、脂肪发生途径分化。调节因子可以促进MSC的软骨发生，例如转化生长因子(TGF-β)和地塞米松，这已经用简单的体外模型得到了证实。进而，专利技术人通过一系列研究发现，采用脐带来源的间充质干细胞(UmbilicalCordMesenchymalstemcells,UCMSC)移植到病人的膝关节损伤处，能够有效治疗软骨损伤。并且，目前已有成熟的UCMSC分离培养方法，并且脐带易获取，不需要对病人采取侵入性手术，也不需要在其它位置提取软骨，能够有效减少病人的痛苦。且MSC能够快速增殖和自我更新，具有成软骨分化的潜能，能够保证新生软骨细胞的活力，并且不存在发病率的隐患。进一步，专利技术人在移植前，对部分UCMSC进行成软骨诱导分化，以促进UCMSC向软骨方向分化，并将UCMSC和诱导的软骨细胞与胶原以及温敏型水凝胶复合，结果能够有效防止细胞大面积迁移，达到长期治疗的效果。其中，温敏型聚乳酸水凝胶在37℃以下为液体，在达到37℃后将形成凝胶，起着外源性细胞载体的作用，可以促进细胞的移动、黏附、增殖及分化，并提供结构支持，使得细胞在缺损处活动，不会大面积移动。因而，在本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种软骨细胞组合物。根据本专利技术的实施例，该软骨细胞组合物包括：细胞悬液和温敏型水凝胶，其中细胞悬液是通过将间充质干细胞和软骨细胞混合并重悬于胶原溶液形成的。专利技术人惊奇地发现，本专利技术的软骨细胞组合物方便获得、安全可靠，并且，向软骨细胞分化的效率高，能够为软骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，而温敏型水凝胶具有很好的外源性细胞载体的作用，能够使组合物中的细胞充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移，从而能够有效促进软骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。根据本专利技术的实施例，在所述细胞悬液中，所述间充质干细胞和所述软骨细胞的混合比例为1:1～4:1。由此，软骨分化效率高，能够为软骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞。根据本专利技术的实施例，在所述细胞悬液中，胶原的含量为1质量％～8质量％。由此，细胞混合物与胶原以及温敏型水凝胶的复合效果好，能够有效防止细胞大面积迁移，从而可以达到长期治疗的效果。根据本专利技术的实施例，所述胶原为Ⅱ型胶原蛋白。由此，细胞混合物与胶原以及温敏型水凝胶的复合效果好，能够有效防止细胞大面积迁移，从而可以达到长期治疗的效果。根据本专利技术的实施例，所述胶原溶液的浓度为1质量％～8质量％。由此，细胞混合物与胶原以及温敏型水凝胶的复合效果好。根据本专利技术的实施例，所述细胞悬液和所述温敏型水凝胶的体积比为1:1～2。由此，温敏型水凝胶对细胞悬液中的间充质干细胞和软骨细胞混合物的承载效果好，进而能够使组合物中的细胞充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移，从而能够有效促进软骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。根据本专利技术的实施例，所述温敏型水凝胶为温敏型聚乳酸水凝胶。由此，能够有效承载间充质干细胞和软骨细胞混合物，并使其充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移。根据本专利技术的实施例，所述温敏型聚乳酸水凝胶为MPEG-PLGA。由此，其作为外源性细胞载体的作用好，能够使组合物中的细胞充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移，从而能够有效促进软骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。根据本专利技术的实施例，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。由此，间充质干细胞来源广泛，易获得，安全无害，且向软骨分化的效率高。根据本专利技术的实施例，所述软骨细胞是通过间充质干细胞优选脐带间充质干细胞诱导获得的。并且，软骨细胞的诱导方法不受特别限制，只要能够从间充质干细胞优选脐带间充质干细胞有效诱导获得软骨细胞即可。由此，软骨细胞组合物，向软骨细胞分化的效率高，能够为软骨损伤部位提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种软骨细胞组合物，其特征在于，包括：细胞悬液和温敏型水凝胶，其中细胞悬液是通过将间充质干细胞和软骨细胞混合并重悬于胶原溶液形成的。

【技术特征摘要】
1.一种软骨细胞组合物，其特征在于，包括：细胞悬液和温敏型水凝胶，其中细胞悬液是通过将间充质干细胞和软骨细胞混合并重悬于胶原溶液形成的。2.根据权利要求1所述的软骨细胞组合物，其特征在于，在所述细胞悬液中，所述间充质干细胞和所述软骨细胞的混合比例为1:1～4:1。3.根据权利要求1所述的软骨细胞组合物，其特征在于，在所述细胞悬液中，胶原的含量为1质量％～8质量％。4.根据权利要求1所述的软骨细胞组合物，其特征在于，所述细胞悬液和所述温敏型水凝胶的体积比为1:1～2。5.根据权利要求1所述的软骨细胞组合物，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，姚海雷，南雪，岳文，游子娟，
申请(专利权)人：华南生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44