一种鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及制备方法技术

本发明专利技术提供一种防治鸭2型腺病毒病的卵黄抗体，其制备过程中使用的抗原为灭活后的GD株病毒制备的疫苗；所述的鸭2型腺病毒GD株，于2016年6月5日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201633。本发明专利技术制备的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体安全性良好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部和全身不良反应。经过鉴定、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用攻毒后注射法和注射后攻毒法评估卵黄抗体的使用效果。结果显示，本发明专利技术中制备的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体能够有效的预防和治疗鸭2型腺病毒病的感染，具有很好的商品化开发前景。

Yolk antibody of duck type 2 adenovirus disease and preparation method thereof

The invention provides an egg yolk antibody against duck adenovirus type 2 disease, its preparation process using the inactivated vaccine GD strain virus antigen for preparation of live after; the duck adenovirus type 2 GD strain in June 5, 2016, preservation of culture collection center in Wuhan University Chinese typical, preserved number CCTCC No:V201633. The yolk antibody of duck type 2 adenovirus disease produced by the invention has good safety, and no local and systemic adverse reactions caused by the yolk antibody appear. After analysis and identification, safety test, validity test data, the indicators are stable and effective; utilization of yolk antibody injection and injection use effect evaluation method after challenged with virulent virus. The results showed that the yolk antibody of duck type 2 adenovirus disease produced in this invention can effectively prevent and treat the infection of duck type 2 adenovirus disease, and it has a very good prospect of commercial development.

【技术实现步骤摘要】
一种鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及制备方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种防治鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及其制备方法。
技术介绍
腺病毒是家禽常见的传染性病原体。禽腺病毒分为三个群：Ⅰ群是从鸡、火鸡、鹅和鸭的呼吸道感染分离出来的禽腺病毒，有共同的群特异性抗原，可分为A、B、C、D、E5个种和12个血清型；鸭2型腺病毒属于Ⅰ群禽腺病毒，是1977年法国匈牙利人从患病番鸭上分离出来的，感染鸭主要表现精神沉郁，下痢，消瘦等症状。近年来，我国养鸭业发展迅速，尤其是散养户较多，一些养鸭设施简陋，消毒意识淡薄及环境卫生不到位等原因，疾病流行情况复杂造成一些新的变异株及不同血清型毒株出现。病毒一旦带入鸭群很难清除，给番鸭养殖业造成严重的经济损失。目前，国内外仅有预防这种病的商品化的灭活疫苗，一方面，免疫后产生抗体时间长、保护率低、经济价值高；另一方面，鸭群发病时，不能及时、快速治疗。基于以上两点，研制安全有效的卵黄抗体迫在眉睫，必须通过创新技术克服这一问题。专利技术人筛选了一株变异的优良病毒株来制备疫苗免疫番鸭，采集高免鸭蛋制备卵黄抗体，可用于鸭2型腺病毒病的紧急预防和早期感染的治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种防治鸭2型腺病毒病的卵黄抗体及其制备方法。从而弥补现有技术的不足。本专利技术所提供的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体，其制备过程中使用的抗原为灭活后的GD株病毒制备的疫苗；所述的鸭2型腺病毒GD株，于2016年6月5日保藏在武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：V201633。本专利技术所提供的卵黄抗体的制备方法，是将使用的抗原为灭活后的GD株病毒的疫苗免疫番鸭，经分离高免鸭蛋蛋黄、萃取、过滤、灭活精制而成。其具体制备方法如下：1)疫苗制备：将GD株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h，灭活的病毒液与油佐剂1:2混合乳化，得到鸭2型腺病毒病的灭活疫苗；1)免疫：第1次免疫：开产前2～3周，1.0ml/只；第2次免疫：第1次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；第3次免疫：第2次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；第4次免疫：第3次免疫后2周，加强免疫1.0ml/只；第N次免疫：第N-1次免疫后，每隔6～8周，加强免疫1.0ml/只；3)采蛋第4次免疫后一周开始，每隔5天抽样高免鸭蛋，测定蛋黄中鸭2型腺病毒的琼扩抗体效价，蛋黄琼扩抗体效价≥1:32时收集高免蛋，2～8℃贮存备用，贮存时间不超过14日。4)精制卵黄抗体制造对高免蛋进行蛋壳消毒、打蛋分离蛋黄、巴氏灭活Ⅰ、酸化萃取、离心分离、辛酸灭活Ⅱ、深滤、甲醛灭活Ⅲ、超滤除病毒、调配总混、过滤除菌得到抗体。卵黄抗体在制备用于预防和治疗鸭2型腺病毒病的感染的制品中的应用。本专利技术制备的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体安全性良好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部和全身不良反应。经过鉴定、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用攻毒后注射法和注射后攻毒法评估卵黄抗体的使用效果。结果显示，本专利技术中制备的鸭2型腺病毒病的卵黄抗体能够有效的预防和治疗鸭2型腺病毒病的感染，具有很好的商品化开发前景。具体实施方式专利技术人筛选了发生变异的型腺病毒病毒株，在筛选该毒株的基础上形成了本专利技术。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例11、GD株的筛选2015年专利技术人成功从广东某养鸭场的鸭群中分离出一株鸭2型腺病毒。经PCR检测和Hexon测序，其核苷酸序列为SEQIDNO:1,编码的氨基酸序列为SEQIDNO:2。通过NCBIBLAST比对分析，分离株Hexon基因与Ⅰ群禽腺病毒属于同一分支，与GenBank数据库中GR株(登录号：NC_024486.1)的核苷酸、氨基酸同源性分别为99.02％和99.70％。GD株与GR株的Hexon所编码的氨基酸第71位、160位、177位、213位、598位、634位不同，GD株以上六个位点编码的氨基酸分别为缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)、异亮氨酸(I)，GR株株以上六个位点编码的氨基酸分别为异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)。GD株与GenBank数据库中I群禽腺病毒的部分核苷酸同源性为31％～88％，详细见表1。表1分离的GD株与I群禽腺病毒Hexon基因的核苷酸同源性比较2GD株的毒种繁殖取11～13日龄的番鸭胚，用0.25％胰酶进行消化，加入适量含10％血清的M199培养液进行培养。挑选已长满单层的MDEF，弃掉原培养液，加入终浓度1％毒种(GD株原始毒种第3代)无血清的M199维持液，37℃静置培养60～78h，可出现明显的细胞病变，当细胞病变达80％以上时收获。按此方法连传10代，分别标记为C4～C10代。测定每代次病毒含量。将检验无菌且病毒含量≥106.0TCID50/0.1ml病毒液混合，定量分装，冻干保存。作为基础种子和生产用毒种备用。3GD株的抗原制备按上述“毒种繁殖”方法用生产毒种接种长满单层的MDEF，收获病毒，反复冻融2次，低速离心去沉淀。测定的病毒含量为107.75TCID50/0.1ml，大于106.0TCID50/0.1ml，判为合格。4GD株病毒液的灭活及检验将合格的GD细胞病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.2％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌)后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种已长满单层的MDEF(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种的鸭胚成纤维细胞作空白对照，37℃、5％CO2培养箱培养，观察168小时。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时。结果所有细胞孔均没有出现CPE，说明灭活完全。5灭活疫苗的制备将灭活彻底的抗原液制备成水相，白油制备成油相。取油相2份导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入水相1份后，1000r/min，乳化30分钟，即成油乳剂灭活疫苗。6安全检验皮下免疫1日龄番鸭10只，每只颈部皮下分点注射疫苗1.0ml，观察21d，生长发育均正常，精神状态良好，且不出现注射疫苗引起的明显局部或全身反应。7疫苗免疫效果检测7.1血清学方法和免疫攻毒法取21日龄番鸭20只，其中10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另10只不接种，作为对照，接种后21～28日采血，分离血清，用鸭2型腺病毒GD株测定血清的琼扩抗体效价，免疫组琼扩抗体9/10阳性，对照组全部为阴性。免疫后21～28日，所有免疫鸭和对照鸭，肌肉注射病毒液(约含106.0TCID50/0.1ml)，每只0.2ml。观察并详细记录免疫鸭和对照鸭的发病情况。结果显示：免疫组28日及以后琼扩抗体均≥9/10阳性，对照组鸭全部为阴性；免疫鸭攻毒后观察14日，保护数均不少于9只；对照鸭攻毒7日内全部发病，死亡9只，死亡鸭(死亡后剖检)及发病鸭(攻毒后7日剖检)剖检病理变化：均出现典型的肝脏肿大和坏死，脾脏、肾脏等多个器官坏死。与此同时，用目前市场上出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭2型腺病毒病的卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体的制备过程中使用的抗原为灭活后的GD株病毒制备的疫苗；其中鸭2型腺病毒GD株的保藏编号为CCTCC No：V201633。

【技术特征摘要】
1.一种鸭2型腺病毒病的卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体的制备过程中使用的抗原为灭活后的GD株病毒制备的疫苗；其中鸭2型腺病毒GD株的保藏编号为CCTCCNo：V201633。2.保藏编号为CCTCCNo：V201633的鸭2型腺病毒GD株在制备卵黄抗体中的应用。3.权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是将使用灭活的保藏编号为CCTCCNo：V201633的鸭2型腺病毒GD株作为抗原制备的疫苗免疫番鸭，经分离高免鸭蛋蛋黄、萃取、过滤、灭活精制而成。4.如权利要求1或3所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体的制备方法包括如下的步骤：1)疫苗制备：将GD株病毒液中加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h，灭活的病毒液与油佐剂1:2混合乳化，得到鸭2型腺病毒病的灭活疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：王相芹，王丹娜，刘阳，王学波，张海波，颜瑞娟，胡秀香，王赛，林文超，李朝阳，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37