基于hemin‑石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法技术

本发明专利技术公开一种基于hemin‑石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法，所述方法步骤如下：(1)选取激活DNA(2)合成H‑GNs(hemin‑石墨烯)复合材料；(3)激活DNA、PARP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD

Methods to detect the activity of PARP hemin graphene based composites

The invention discloses a method for detection and analysis of the PARP activity of hemin graphene composite materials based on the steps of the method are as follows: (1) select the activation of DNA (2) H GNs (hemin synthesis of graphene composite materials); (3) the activation of DNA, PARP, nicotinamide adenine dinucleotide (NAD

【技术实现步骤摘要】
基于hemin-石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法
本专利技术属于一种定量检测PARP(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)活性的技术，涉及石墨烯复合材料在临床检测的应用，具体涉及石墨烯复合材料定量检测生物酶的应用领域。
技术介绍
PARP，也称聚ADP-核糖聚合酶，是一类存在于绝大多数真核生物中能催化多聚ADP核糖基化的细胞核酶，结构主要包括三个区域：DNA结合域、自身修饰域、催化域。PARP能够结合各种DNA结构和核小体，并且具有NAD+依赖的催化活性，可在目标蛋白上合成聚(ADP-核糖)聚合物。聚(ADP-核糖)聚合物的形成显著改变了受体蛋白的电荷特性，引发了DNA损伤的控制和修补过程。PARP在基因稳定和肿瘤的发生发展、炎症和应激反应、代谢和能量消耗、昼夜节律等方面都起重要的调节作用。而且PARP在恶性肿瘤与正常组织中的表达存在有差异性，且这种差异性有可能在疾病的发生发展中起重要作用。近几年，PARP在DNA损伤修复和维持基因组的稳定性的作用引起世人的关注。在此基础上，运用抑制剂抑制PARP参与介导的肿瘤细胞DNA损伤修复，更是当前研究热点之一。PARP活性检测的传统技术主要有酶联免疫法，使用抗-PAR的单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠1gG二抗，建立检测沉积在免疫组蛋白上的PAR的比色方法或化学发光方法；或者采用放射性NAD+的方法来测定了PARP的酶活性。但此类方法有的需要标记，具有成本高、需要样品量较大、灵敏性差、检测时间长的缺点，而且有时候会得到假阳性结果。目前，Hergenrother等采用化学定量NAD+的方法间接测定了PARP-1的酶活性，可用于小分子抑制剂的高通量筛查；并合成了ADP-ribose-pNP显色底物，发展了简单、灵敏的比色方法来评价PARP的活性。然而，这种方法需要繁琐的合成。因此，该方法存在很多局限性。近年来，为解决PARP分析方法的弊端，研究者们已经开发了许多简单、可执行的分析方法并将之应用到PARP活性的检测中，例如比色检测、荧光检测、电化学检测等。例如，湖南大学聂舟教授利用PAR对荧光蛋白scGFP与阳离子聚合物CCP间荧光共振能量转移效率的调节作用，建立了PARP活性的荧光检测方法；南京师范大学戴志晖教授利用六氨合钌做指示剂，根据PAR静电吸附六氨合钌的量建立了PARP的电化学检测新方法；南京大学李根喜教授利用PARP引起修饰有辅酶NAD金胶的聚集，建立了PARP活性的比色检测法。受以上方法的启发，我们建立了一种基于hemin-石墨烯复合材料比色检测PARP活性的方法。此方法无需标记，易操作，而且与上述的比色方法相比，具有稳定性高、检测线低、检测范围广的优点。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术的问题，提供了一种基于hemin-石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法。本专利技术中利用PARP催化合成的聚ADP核糖链带有大量的负电，会使在一定盐浓度下的H-GNs发生分散程度的变化。在TMB和H2O2存在下，通过得到的显色程度不同的变化来测定PARP活性。它具有灵敏度高、准确性好、无标记等优点。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于hemin-石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法，包括以下步骤：(1)选取激活DNA激活PARP(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)；(2)合成H-GNs(hemin-石墨烯)复合材料；(3)将激活DNA、PARP、NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)混合反应，合成了带大量负电荷的PAR(聚ADP-核糖)聚合物；(4)将所述H-GNs复合材料与所述PAR聚合物混合反应，加入盐溶液，记录H-GNs与PAR聚合物产物的团聚变化；(5)利用紫外-可见光谱仪对步骤(4)获得的产物溶液进行定量检测。作为本专利技术改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：步骤(1)中所述激活DNA的序列选自上海生物工程有限公司：单链DNA1：5’-CCCGTGCGTGCGCGAGTGAGTTGGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3’单链DNA2：5’-CAACTCACTCGCGCACGCACGGG-3’形成激活双链DNA的方法为：激活DNA单链在95℃水浴反应3-10分钟后，冷却至室温，形成杂交的双链DNA，所述双链DNA与所述PARP进行反应，以激活PARP的活性。作为本专利技术改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述步骤(2)具体如下：称取10mg氧化石墨溶于10-40mL二次水中所述氧化石墨的浓度为0.2-1mg/mL，超声分散2～4h进行机械剥离，2000～4000rpm转速下离心20～30min，除去未剥离的氧化石墨，取上清液在透析袋(MW：8000～12000)中透析一周除去杂质小分子得分散均匀的氧化石墨烯；将上述氧化石墨烯溶液与10-40mL溶于0.1MNaOH溶液的hemin在烧瓶中充分混合，所述hemin的浓度为0.2-1mg/mL；之后缓慢加入150～200μL氨溶液，最后加入20～50μL水合肼，剧烈搅拌混合溶液30～60min，将烧瓶置于60℃水浴中反应3～24h，得到稳定分散的黑色溶液；将上述黑色溶液在12000～13000rpm转速下离心30～60min得黑色沉淀物，水洗3～5次得到容易重新分散在水中的H-GNs复合材料。作为本专利技术改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述步骤(3)具体如下：用反应缓冲溶液将所述PARP配置成不同的浓度，在含有所述激活DNA、所述NAD+的反应缓冲溶液中滴加不同浓度的PARP，于30～38℃条件下反应1～2h。作为本专利技术改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述激活DNA浓度为100～200nM。作为本专利技术改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述NAD+浓度为100～500μM。作为本专利技术改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述反应缓冲溶液为含有KCl、MgCl2、Zn(OAc)2的pH7.2～7.4的50mMTris-HCl，所述KC1初始浓度为50mM，MgCl2初始浓度为2mM，Zn(OAc)2初始浓度为50μM。作为本专利技术改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述步骤(4)具体如下：将所述H-GNs复合材料加入到所述PARP催化反应合成的所述PAR聚合物混合反应溶液中，反应20～40min，之后加入NaCl溶液，在20～30℃条件下反应30～50min，离心取上层清液加入到磷酸缓冲溶液中，在TMB和H2O2存在下，对其溶液进行记录和紫外-可见光谱检测。作为本专利技术改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述磷酸缓冲溶液为pH5～6的25～50mM的磷酸缓冲溶液。作为本专利技术改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述NaCl的浓度为0.01～1.0M，所述TMB和H2O2的最终浓度分别为0.1～1.0mM和5～30mM。相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术无需标记，简化了检测方法，避免了标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。(2)本专利技术利用hemin-石墨烯复合材料具有内在的类过氧化氢酶活性、在盐溶液中具有可调控的分散性，而且通过II-II作用可吸附单链DNA，是一种具有很大潜力的检测材料。(3)本专利技术有效利用了纳米材料的特性，不需要借助本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于hemin‑石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)选取激活DNA激活PARP(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)；(2)合成H‑GNs(hemin‑石墨烯)复合材料；(3)将激活DNA、PARP、NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)混合反应，合成了带大量负电荷的PAR(聚ADP‑核糖)聚合物；(4)将所述H‑GNs复合材料与所述PAR聚合物混合反应，加入盐溶液，记录H‑GNs与PAR聚合物产物的团聚变化；(5)利用紫外‑可见光谱仪对步骤(4)获得的产物溶液进行定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于hemin-石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)选取激活DNA激活PARP(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)；(2)合成H-GNs(hemin-石墨烯)复合材料；(3)将激活DNA、PARP、NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)混合反应，合成了带大量负电荷的PAR(聚ADP-核糖)聚合物；(4)将所述H-GNs复合材料与所述PAR聚合物混合反应，加入盐溶液，记录H-GNs与PAR聚合物产物的团聚变化；(5)利用紫外-可见光谱仪对步骤(4)获得的产物溶液进行定量检测。2.根据权利要求1所述的基于hemin-石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法，其特征在于，步骤(1)中所述激活DNA的序列为：单链DNA1：5’-CCCGTGCGTGCGCGAGTGAGTTGGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3’单链DNA2：5’-CAACTCACTCGCGCACGCACGGG-3’形成激活双链DNA的方法为：激活DNA单链在95℃水浴反应3-10分钟后，冷却至室温，形成杂交的双链DNA，所述双链DNA与所述PARP进行反应，以激活PARP的活性。3.根据权利要求1所述的基于hemin-石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体如下：称取10mg氧化石墨溶于10-40mL二次水中所述氧化石墨的浓度为0.2-1mg/mL，超声分散2～4h进行机械剥离，2000～4000rpm转速下离心20～30min，除去未剥离的氧化石墨，取上清液在透析袋(MW：8000～12000)中透析一周除去杂质小分子得分散均匀的氧化石墨烯；将上述氧化石墨烯溶液与10-40mL溶于0.1MNaOH溶液的hemin在烧瓶中充分混合，所述hemin的浓度为0.2-1mg/mL；之后缓慢加入150～200μL氨溶液，最后加入20～50μL水合肼，剧烈搅拌混合溶液30～60min，将烧瓶置于60℃水浴中反应3～24h，得到稳定分散的黑色溶液；将上述黑色溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，徐晓林，卫伟，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南,41