蝎α‑型神经毒素的突变体及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种蝎α‑型神经毒素的突变体或其片段，所述突变体包括如SEQ ID NO：1所示的序列，并且突变位点位于所述序列的N‑转角，B环和J环三个结构域中。本发明专利技术还提供了编码所述突变体的DNA序列，用于转化所述序列的宿主细胞。本发明专利技术发现的蝎α‑型神经毒素突变体，不仅消除了对老鼠的毒性，而且保留甚至增强了对昆虫的毒性，不仅可以用于研发增效型微生物杀虫剂，还可以用作肽类杀虫剂，而且本发明专利技术首次使用进化生物信息学的方法指导开发杀虫分子的先导物，具有十分广阔的应用前景。

Scorpion neurotoxin alpha mutant type and its use

The invention provides a scorpion neurotoxin alpha type mutant or fragment, the sequence of SEQ ID mutants including shown by NO:1, and mutation is the sequence of N angle, B and ring J three domain. The present invention also provides a DNA sequence encoding the mutant, which is used to transform the host cell of the sequence. Scorpion neurotoxin alpha type mutants found by the invention, not only eliminates the mouse toxicity, and retention and enhanced toxicity to insects, not only can be used to develop the synergistic microbial insecticide can also be used as a precursor of peptide insecticides, and method of the invention is used for the first time in bioinformatics to guide the development of insecticidal molecules. It has very broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
蝎α-型神经毒素的突变体及其用途本申请要求2016年04月22号提交的名称为“蝎α-型神经毒素的突变体及其用途”，申请号为201610251397.0的专利技术专利申请的优先权。
本专利技术属于生物
，涉及一种多肽的突变体及其用途，具体涉及蝎α-型神经毒素的突变体及其在制备多肽类杀虫剂中的用途。
技术介绍
我国为农业大国，害虫种类繁多，严重威胁我国粮食和其它农作物的产量。目前，我国的害虫防治主要依赖于化学类农药(如有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类等)。这些农药的持续和大量的使用，一方面造成了害虫耐药性的日益增加；同时农药残留对环境和人类健康造成影响。为了寻求高效低毒的害虫防治措施，近几年，杀虫微生物，如白僵菌和绿僵菌正日益受到重视。与化学类农药相比，杀虫微生物具有明显的优势：1)物种选择性高导致对人畜和自然环境安全无害；2)繁殖快，生产成本低；3)害虫不易产生抗药性；4)有自然传播感染的能力，在环境中存活力强，可以长期压低虫口密度；5)害虫不易产生抗药性。尽管如此，微生物杀虫剂也有两个主要的缺点：1)杀虫谱窄，只针对特定种类的害虫；2)感染的潜伏期导致杀虫效果慢，造成实质性经济损失。电压门控钠通道(Voltage-gatedNa+channel，Nav)广泛分布于昆虫和哺乳动物的肌肉、神经元、腺体、心肌的可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其活动与细胞的兴奋、收缩、分泌和突触传递等特异性功能密切相关，也是重要的药物靶点。哺乳动物基因组编码至少9个不同亚型的电压门控钠通道，分别命名为Nav1.1-Nav1.9。不同亚型的钠通道分别在不同组织中表达。以人类为例，Nav1.1，Nav1.6和Nav1.9主要在中枢和周围神经系统表达；Nav1.2和Nav1.3主要在大脑表达，Nav1.4分布于骨骼肌；Nav1.5分布于心肌；Nav1.7和Nav1.8主要分布于背根神经节。这些钠通道具有相似的结构构架，分成4个相似的结构域(D1-D4)，每个结构域由6个跨膜的α-螺旋(S1-S6)组成，前四个螺旋(S1-S4)为电压感受器区，S5-S6为孔形成区。蝎是一类有毒动物，以昆虫和蜘蛛等小型节肢动物为食。条斑钳蝎(Mesobuthuseupeus)是一种小型的沙漠类蝎，主要分布在我国东北以及土耳其、伊朗、俄罗斯和蒙古等部分国家，以小型昆虫(如蟋蟀和蟑螂)为食。毒液在蝎捕食和防御过程中发挥关键作用，在大多数钳蝎科(Buthidae)毒液中存在蝎α-型神经毒素，是这类蝎种主要的毒性成分。条斑钳蝎的α-型神经毒素为一个多基因家族，由超过14个的毒素成员组成，这类毒素组成了一个进化上保守的多肽家族，由大约60-76个氨基酸组成，含有4对二硫键，属于典型的半胱氨酸稳定的α-螺旋和β-折叠构架，靶向电压门控钠通道。蝎α-型神经毒素为该家族的一个亚家族分支，其成员通过与钠通道细胞外表面的受体位点3结合，延缓通道失活过程并放大峰电流。基于毒素的药理学特征和物种选择性，α-型神经毒素被分成3个功能组：1)经典α-型神经毒素；2)昆虫α-型神经毒素；3)α-like毒素。研究表明，这类毒素能够与猎物的电压门控钠通道的受体位点相互作用，修饰通道的门控特性(激活和失活)导致猎物软瘫和死亡。作为高亲和性配体，这类毒素为研究钠通道的结构和药理学功能提供了最佳的分子工具，并且由于其独特的结构特征，长期以来它一直是结构生物学家用于研究蛋白质结构-功能关系的理想模型；另外，由于其强的杀昆虫毒性，这类毒素也被认为是设计肽类杀虫剂的有效模板。特别是作为杀虫微生物的增效剂具有诱人的前景。但是，蝎钠通道毒素特异性作用于哺乳动物、昆虫和甲壳虫动物神经细胞的钠通道，使动物出现神经症状并导致死亡。进一步地，尽管目前已经发现了大量的α-型神经毒素，并获得了广泛的药理学和空间结构数据，但是这类毒素的物种选择性的结构和进化基础仍没有分辨。基于这两点，极大的限制了蝎钠通道毒素作为肽类杀虫剂的应用。
技术实现思路
基于上述不足，本专利技术人利用定点突变，结合电生理和活体功能检测技术，系统完成了蝎α-型神经毒素中加速替代的氨基酸位点的分子解剖和功能评估。本专利技术人惊奇地发现，蝎α-型神经毒素的大多数正选择位点定位于毒素-钠通道受体位点的作用界面，通过对蝎α-型神经毒素正选择位点的系统性功能评估，发现了蝎α-型毒素调控物种(昆虫/哺乳动物)选择性的关键氨基酸位点，以及其在调节毒素对哺乳动物/昆虫选择性中的关键作用，其中的热点氨基酸残基的突变导致了蝎α-型神经毒素对哺乳动物钠通道毒性的不同程度直至完全丧失，而毒素的昆虫毒性得以保留甚至不同程度地加强。因此，本专利技术提供了一种蝎α-型神经毒素的突变体，该突变体可以高度选择性地靶向昆虫钠通道，从而可以作为肽类杀虫剂应用，并且也为进一步构建转基因的增效型微生物杀虫剂奠定基础。一方面，本专利技术提供了一种蝎α-型神经毒素的突变体或其片段，其中，所述蝎α-型神经毒素的序列如SEQIDNO：1所示，并且所述突变体或其片段的突变位点位于所述蝎α-型神经毒素的N-转角、B环和/或J环三个结构域中：SEQIDNO：1：ARDAYIAKPHNCVYECFDAFSSYCNGVCTKNGAKSGYCQILGTYGNGCWCIALPDNVPIRIPGKCH。其中，所述N-转角位于SEQIDNO：1的第8位到第12位氨基酸、所述J环位于SEQIDNO：1的第17位到第23位氨基酸和/或所述B环位于SEQIDNO：1：的第39位到第47位氨基酸。所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段相对于野生型蝎α-型神经毒素至少有一个氨基酸发生突变，所述突变包括氨基酸的取代、缺失或插入。在本专利技术的蝎α-型神经毒素的突变体或其片段中，可以有一个至六个氨基酸发生突变，优选地，只有一个氨基酸位点发生突变。优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的至少一个突变的氨基酸位点位于SEQIDNO：1所示的序列的K8、P9、E15、D18、A19、F20、S22、I40、l41、T43和/或A52处。优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段可以包括将第八位的赖氨酸突变为丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸或天冬氨酸；第九位的脯氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；第十五位的谷氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；第十八位的天冬氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或精氨酸；第十九位的丙氨酸突变为苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸；第二十位的苯丙氨酸突变为酪氨酸或色氨酸；第二十二位的丝氨酸突变为丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或甘氨酸；第四十位的异亮氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；第四十一位的亮氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；第四十三位的苏氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸或谷氨酸；第五十二位的丙氨酸突变为缬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蝎α‑型神经毒素的突变体或其片段，其特征在于，所述蝎α‑型神经毒素的序列如SEQ ID NO：1所示，并且所述突变体或其片段的突变位点位于所述蝎α‑型神经毒素的N‑转角、B环和/或J环三个结构域中：SEQ ID NO：1：ARDAYIAKPHNCVYECFDAFSSYCNGVCTKNGAK SGYCQILGTYGNGCWCIALPDNVPIRIPGKCH；优选地，所述N‑转角位于SEQ ID NO：1的第8位到第12位氨基酸、所述J环位于SEQ ID NO：1的第17位到第23位氨基酸和/或所述B环位于SEQ ID NO：1：的第39位到第47位氨基酸；优选地，所述蝎α‑型神经毒素的突变体或其片段的至少一个突变的氨基酸位点位于SEQ ID NO：1所示的序列的K8、P9、E15、D18、A19、F20、S22、I40、l41、T43和/或A52处。

【技术特征摘要】
2016.04.21 CN 20161025139701.一种蝎α-型神经毒素的突变体或其片段，其特征在于，所述蝎α-型神经毒素的序列如SEQIDNO：1所示，并且所述突变体或其片段的突变位点位于所述蝎α-型神经毒素的N-转角、B环和/或J环三个结构域中：SEQIDNO：1：ARDAYIAKPHNCVYECFDAFSSYCNGVCTKNGAKSGYCQILGTYGNGCWCIALPDNVPIRIPGKCH；优选地，所述N-转角位于SEQIDNO：1的第8位到第12位氨基酸、所述J环位于SEQIDNO：1的第17位到第23位氨基酸和/或所述B环位于SEQIDNO：1：的第39位到第47位氨基酸；优选地，所述蝎α-型神经毒素的突变体或其片段的至少一个突变的氨基酸位点位于SEQIDNO：1所示的序列的K8、P9、E15、D18、A19、F20、S22、I40、l41、T43和/或A52处。2.如权利要求1所述的突变体或其片段，其中，所述突变体或其片段包括将第八位的赖氨酸突变为丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸或天冬氨酸；第九位的脯氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；第十五位的谷氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺；第十八位的天冬氨酸突变为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或精氨酸；第十九位的丙氨酸突变为苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸；第二十位的苯丙氨酸突变为酪氨酸或色氨酸；第二十二位的丝氨酸突变为丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或甘氨酸；第四十位的异亮氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；第四十一位的亮氨酸突变为丙...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱顺义，高斌，朱丽梅，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11