本发明专利技术提供海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其应用。通过对抗菌肽NZ17074分子结构进行优化设计，得到一个新型衍生肽N2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术的抗菌肽N2对革兰氏阴性菌具有很好的杀菌效果，并且显著降低了对小鼠红细胞的溶血活性以及对鼠源巨噬细胞的细胞毒性。小鼠毒血症模型试验结果表明，抗菌肽N2还具有抗内毒素血症作用，能够显著提高小鼠的存活率，并且优于抗生素多黏菌素。抗菌肽N2分子量小，易于人工合成，是极具应用价值的小分子多肽，可用于制备新型抗菌抗感染药物等，具有良好的应用前景。
Antimicrobial peptide NZ17074 derived peptide N2 from sea worm and its application
The present invention provides the antibacterial peptide NZ17074 derived peptide N2 from sea worm and its application. The optimal design of cathelicidin NZ17074 molecular structure, a novel N2 derived peptide, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:1. The antibacterial peptide N2 has a good bactericidal effect on Gram negative bacteria, and significantly reduces hemolytic activity of mouse red blood cells and cytotoxicity to murine macrophages. Mouse sepsis model experiment results show that the antibacterial peptide N2 has anti endotoxin effect, can significantly improve the survival rate of mice, and better than the antibiotic polymyxin. Antibacterial peptide N2 has small molecular weight and is easy to be synthesized. It is a small molecule peptide with high application value. It can be used in the preparation of new antibacterial and anti infective drugs, and has a good application prospect.
【技术实现步骤摘要】
海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其应用
本专利技术涉及抗菌肽及其应用，具体地说，涉及海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其应用。
技术介绍
抗菌肽是由生物有机体产生的前体经蛋白酶降解形成的具有生物学活性的小分子多肽，主要构成了机体防御的第一道防线(ZASLOFF，Antimicrobialpeptidesofmulticellularorganisms.Nature，2002，415：389-395)。抗菌肽对细菌的作用机制主要是以膜作为靶位点，通过静电力和受体介导的细胞膜作用力，引起膜通透性改变，降低细胞膜稳定性，或插入细胞膜中形成跨膜的孔洞，最终导致细菌内容物外泄而死亡。由于抗菌肽特殊的作用机制，使其不易产生耐药性，并且对许多临床耐药菌同样具有杀菌作用。因此，抗菌肽被认为可以替代传统抗生素，应用于饲料添加剂、医药卫生和食品防腐等领域。虽然天然抗菌肽具有普遍的优点，但也存在着某些明显的不足，例如，部分抗菌肽活性相对较低，临床应用中对真核细胞具有强毒性、选择性差，对真核生物体内的正常菌群起到一定的杀伤作用，造成代谢的紊乱，这些都是限制抗菌肽发展的瓶颈。因此，以抗菌肽的结构与功能的关系研究为基础，通过生物信息学方法，对现有抗菌肽进行全新设计和结构改造，以期获得高抗菌活性、低毒性的抗菌肽衍生物。Arenicin是海洋无脊椎动物海蚯蚓体内的一种具有β-折叠构象的抗菌肽，它结构简单，具有广谱抗菌活性，可以抑制多种革兰氏阴性菌、阳性菌和真菌，并且能够有效抑制耐药性大肠杆菌引起的尿路感染。但是在其进一步的临床应用中由于溶血性和细胞毒性而受到制约。因此，通过对抗菌肽的设计改造，保持高的抑菌活性，同时能够显著地降低溶血活性和细胞毒性，是本专利技术所要解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高抗菌活性、极低细胞毒性和低溶血性的海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2及其应用。为了实现本专利技术目的，专利技术人通过对抗菌肽NZ17074分子结构进行优化设计，用丙氨酸(A)替代海蚯蚓抗菌肽NZ17074氨基酸序列中第1和12位的甘氨酸(G)，得到一个突变体抗菌肽N2。突变体N2由21个氨基酸组成，分子量为2570Da，等电点为9.38。该突变体保持了与母体肽相似的杀菌活性的同时，显著降低了溶血性以及细胞毒性，具有良好的应用前景。本专利技术的海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供编码所述衍生肽的基因，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本专利技术还提供含有所述衍生肽编码基因的表达盒。本专利技术还提供含有所述衍生肽编码基因、表达盒的载体。本专利技术还提供含有所述衍生肽编码基因、表达盒、载体的转基因细胞系或工程菌。本专利技术还提供所述衍生肽在制备治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物或组合物中的应用。所述革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌。本专利技术还提供所述衍生肽在制备抗内毒素血症药物或组合物中的应用。本专利技术还提供由所述衍生肽制备的治疗革兰氏阴性菌感染的抗菌药物或组合物。本专利技术进一步提供由所述衍生肽制备的抗内毒素血症药物或组合物。本专利技术的抗菌肽N2对革兰氏阴性菌具有很好的杀菌效果，并且显著降低了对小鼠红细胞的溶血活性以及对鼠源巨噬细胞的细胞毒性。小鼠毒血症模型试验结果表明，抗菌肽N2还具有抗内毒素血症作用，能够显著提高小鼠的存活率，并且优于抗生素多黏菌素。抗菌肽N2分子量小，易于人工合成，是极具应用价值的小分子多肽，可用于制备新型抗菌抗感染药物等，具有良好的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例3中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2的溶血性实验结果。图2为本专利技术实施例3中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽的细胞毒性实验结果。图3为本专利技术实施例4中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2对毒血症小鼠的保护实验结果。图4为本专利技术实施例4中海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽对毒血症小鼠肺组织的保护实验结果；其中，①：LPS注射组，30mg/kg；②：空白对照；③：5mg/kgN2治疗组；④：7.5mg/kgN2治疗组；⑤：15mg/kg粘杆菌素治疗组。图中，T:气道；V:血管；A：肺泡；1：气道上皮增生；2：气道基底膜增厚及出现明显的纤维化；3：大部分肺泡细胞出现塌陷与融合现象；4：气道与血管周围的肺泡细胞内有炎性细胞浸润。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2的设计与合成1、以NZ17074母体肽序列为基础，通过替换和增减氨基酸残基，通过适当增加抗菌肽疏水性和改变二硫键对数进行多肽的改造，最终确定了一个突变体抗菌肽N2，试图提高抗菌肽对革兰氏阴性菌的抑菌活性，抗菌肽N2基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2、抗菌肽合成采用固相合成法，通过十二通道半自动多肽合成仪进行合成。反向高效液相色谱C18柱测定合成肽纯度(>90％)，ESI-MS质谱确认衍生肽N2和N6的分子量。实施例2海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2的抑菌实验本实施例中的病原菌来自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)以及中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，具体菌株如表1所示。衍生肽的最小抑菌浓度(MIC，minimuminhibitoryconcentration)的测定参照临床和实验室标准协会(CLSI，ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)制定的方法(WIEGAND等，Agarandbrothdilutionmethodstodeterminetheminimalinhibitoryconcentration(MIC)ofantimicrobialsubstances.Natureprotocols,2008,3(2):163-175)，根据具体情况略有改动，操作细节如下：将受试菌株的单菌落挑至MH液体培养基中，37℃250rpm振荡过夜培养活化后，转接至MH液体培养基中培养至对数生长期(OD600nm＝0.4～0.6)，然后制备成105CFU/mL的菌液，加入96孔无菌细胞培养板内，每孔90μL。用PBS通过2倍倍比稀释法对NZ17074及其衍生肽进行稀释，每孔10μL抗菌肽，使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625μg/mL，阴性对照组为PBS代替抗菌肽的受试菌液，空白对照组为无菌MH培养基。每个处理做三个平行样。将培养板置于37℃恒温培养箱孵育16～18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，能够完全抑制细菌生长的最低浓度即为抗菌肽对受试菌株的MIC值。如果出现跳孔或平行样间结果不一致的情况，则重新测试。结果如表1所示，抗菌肽对各革兰氏阴性菌种均体现出不同程度的较好抑菌效果。表1海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍本文档来自技高网...
【技术保护点】
海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.海蚯蚓抗菌肽NZ17074衍生肽N2，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.编码权利要求1所述衍生肽的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述表达盒的载体。6.含有权利要求2或3所述基因、权...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，杨娜，王秀敏，滕达，毛若雨，郝娅，
申请(专利权)人：北京生泰云科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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